郭珍 章春泉 陽彥 周欣 戴琳 肖曉娟 李歡

1江西省婦幼保健院（南昌330006）；2南昌大學第二附屬醫(yī)院（南昌330000）

右位主動脈弓（right aortic arch，RAA）是胎兒主動脈弓異常中最常見的一種類型，指主動脈弓位于氣管、食管的右側(cè)，是胚胎時期配對主動脈弓異常退化形成的，占總?cè)焉锏?.1%［1］，占先天性心臟病的約1%～3%［2］。有些孤立性RAA 雖然不引起任何癥狀，但在胎兒時期，它們可以作為胎兒先天性心臟病和染色體非整倍體、22q11 微缺失的標志物。而嚴重的主動脈弓異常與血管環(huán)、先天性心臟病和染色異常相關(guān)，可引起氣管或食管受壓癥狀甚至死亡。而非孤立性RAA 多與復雜先天性心臟畸形同時發(fā)生，在產(chǎn)前胎兒心臟超聲檢查中更易漏誤診。2014年，染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis，CMA）被國內(nèi)遺傳學應用專家一致認可作為產(chǎn)前診斷的一線檢測方法，是一種高分辨率分子遺傳學技術(shù)，結(jié)合超聲影像學檢測，可提高胎兒畸形的診斷率。目前CMA 技術(shù)對胎兒先天性心臟病的檢測已經(jīng)逐步應用到臨床診斷中，但產(chǎn)前微陣列分析對于RAA 胎兒是否檢測到比傳統(tǒng)核型G 帶染色體檢測更多的染色體異常尚不清楚?，F(xiàn)將我院產(chǎn)前和產(chǎn)后證實為RAA 30 例胎兒，同時進行傳統(tǒng)染色體核型分析和微陣列分析，尋找RAA 胎兒基因組中可能存在的致病性拷貝數(shù)變異（CNVs），評估CMA 技術(shù)在胎兒右位主動脈弓的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2016年7月至2018年8月在江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心進行產(chǎn)前診斷的孕婦，孕周15～36 周，孕婦年齡20～36 歲，平均29 歲。所有孕婦均簽署知情同意書，本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準。產(chǎn)期取羊水或臍血或引產(chǎn)胎兒的組織，產(chǎn)后取出生新生兒外周血作為樣本，共30 例。將超聲提示RAA 的胎兒標本，進一步分為孤立性RAA 24 例和伴有心內(nèi)外其他畸形的非孤立性RAA 6 例。所有病例樣本均事先進行常規(guī)G 顯帶染色體核型分析，同時采用CMA 方法檢測胎兒樣本。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與分組 標本采集：羊膜腔穿刺術(shù)，超聲定位進行羊膜腔穿刺，取羊水。腹臍靜脈穿刺術(shù)，超聲定位，經(jīng)腹部進行胎兒臍靜脈穿刺，取臍血。對引產(chǎn)胎兒，取皮膚組織標本。分組：Ⅰ組，孤立性RAA 組：胎兒只存在RAA 一種心血管異常，且產(chǎn)前超聲系統(tǒng)篩查未提示其他結(jié)構(gòu)異常。Ⅱ組：非孤立性RAA 組：除右位主動脈弓異常以外，超聲提示存在心內(nèi)或心外多系統(tǒng)結(jié)構(gòu)畸形。

1.2.2 G 顯帶核型分析 采用細胞增殖同步化方法，對樣本進行培養(yǎng)、固定、消化、染色、掃描，按人類細胞遺傳學國際命名體制描述核型。

1.2.3 染色體微陣列分析CMA 檢測 采用Affymetrix Cytoscan 750 K Array 芯片檢測，羊水細胞基因組DNA 的提取與準備；按芯片平臺標準流程，分別進行酶切、熒光標記酶切DNA、純化、雜交、洗滌、掃描與分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換及CNVs臨床意義分析 參照OMIM、DGV、UCSC、Decipher 數(shù)據(jù)庫資料，檢索PubMed 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)臨床資料并結(jié)合美國醫(yī)學遺傳學會對基因芯片CNVs 結(jié)果進行分析對比。對于復雜可疑的CNVs，用MLPA、FISH、QF-PCR 等方法驗證染色體核型及Array-HCG 結(jié)果的準確性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計分析軟件，計數(shù)資料以頻數(shù)及百分位表示，并采用χ2檢驗或精確概率法進行組間比較；P＜0.05 有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果 共檢出3 例染色體核型異常標本（47，XX+21；45，X；47，XY+18），檢出率為10%（3/30）

2.2 CMA 檢測結(jié)果 共檢出7 例異常，檢出率為23.3%（7/30），2 例胎兒檢 測 出22q.11.2 微缺失（6.7%），2 胎例兒存在其他具有臨床意義的致病性CNVs（9q31.2微缺失，6p21.3微缺失）。見表1。

2.3 30例RAA 胎兒的細胞遺傳學對比 CMA 檢測技術(shù)對RAA 胎兒染色體異常的檢出率比傳統(tǒng)染色體核型分析檢出率提高了13.3%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.92，P=0.166）這可能是本研究的樣本總數(shù)量較小所致。

2.4 孤立性RAA 胎兒組、非孤立性RAA 胎兒組對比 24 例孤立性RAA 檢出CNVs 3 例（12.5%）；6 例伴有心內(nèi)外其他畸形的非孤立性RAA 檢出CNVs 4 例（66.7%）。非孤立性有位主動脈弓的致病性CNVs 率高于孤立性右位主動脈弓，采用FISHER 精確概率法，2 組差異有統(tǒng)計學意義（P=0.016）。

3 討論

RAA 常伴有其他先天性心臟缺陷，包括法洛四聯(lián)癥、永存動脈干和心房異構(gòu)。血管環(huán)是主動脈弓異常變異后形成的，能導致氣管、食管受壓，引起呼吸和胃腸道癥狀。有研究指出，通常與RAA 相關(guān)的染色異常包括DiGeorge 綜合征、21 三體綜合征。然而，時至今日國內(nèi)關(guān)于RAA 異常的產(chǎn)前超聲和遺傳學診斷鮮有報道。

表1 RAA 胎兒的染色體核型分析及CMA 檢測結(jié)果Tab.1 Chromosome karyotype analysis and CMA findings of pathogenic and unknown clinical significance in right aortic arch of fetal

在本研究中，30 例產(chǎn)前超聲提示RAA 結(jié)構(gòu)異常的胎兒中，傳統(tǒng)核型分析檢出3 例染色體數(shù)目異常（47，XX+21；45，X；47，XY+18；），檢出率為10%。超聲結(jié)構(gòu)異常的胎兒中，染色體核型異常檢出率約在9%～19%之間，主要為染色體三倍體及非整倍體［3］，本研究中RAA 檢出率與相關(guān)文獻報道一致，可以說RAA 胎兒大多數(shù)具有正常的染色體數(shù)目。在核型正常的27 例胎兒中通過CMA檢測4 例攜帶致病性CNVs，檢出率約為13.3%。相關(guān)文獻［4］報道：超聲結(jié)構(gòu)異常通過SNP array 技術(shù)檢出率在5.2%～10%之間。而本研究數(shù)據(jù)（13.3%）高于文獻報道的檢出率。 筆者認為，胎兒RAA 異常的CNVs 發(fā)生率，可能高于一般的超聲結(jié)構(gòu)異常的CNVs，也有可能本研究是一高度選擇的研究人群，排除了共存的主要心內(nèi)異常且數(shù)據(jù)樣本較小，因此，我們的結(jié)果與該領(lǐng)域其他研究相比較時，產(chǎn)生了一定的影響。其發(fā)生率有待大樣本人群數(shù)據(jù)研究。但不論如何，當胎兒發(fā)現(xiàn)RAA 異常，尤其胎兒RAA 合并迷走鎖骨下動脈時，其染色體異常的檢出率總體偏高。同時，本研究也證明微陣列分析鑒定的亞顯微染色體異常，其多數(shù)不能通過G 帶核型檢測到。CMA 的檢出染色體異常的敏感性遠高于傳統(tǒng)的核型染色體技術(shù)。CMA 能檢測全基因組亞顯微水平的染色體變異，包括重復、缺失、中性拷貝數(shù)的雜合性缺失LOH 以及嵌合體等，分為微陣列比較基因組雜交技術(shù)Array-CGH 和單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)SNP array，分辨率為31 kb［5］。

主動脈弓異常與染色體異常，特別是與22q11.2微缺失的相關(guān)性為12.6%～24%［6-7］，RAZON 等［8］研究發(fā)現(xiàn)14 例RAA 或者中有4 例有22q11 微缺失和47XXY 異常。本研究中，筆者檢出在4 例CNVs胎兒中，有2 例22q11.2 微缺失綜合征（2/30 6.7%），均表現(xiàn)為兩種以上的畸形，一例胎兒為單純的RAA 合并迷走右鎖骨下動脈，沒有其他心內(nèi)結(jié)構(gòu)異常。而在另一名22q11.2 微缺失胎兒，合并室間隔缺損、法洛四聯(lián)癥、胼胝體缺如、單臍動脈。這也說明RAA 異常不論是否合并其他心內(nèi)外畸形，都可能與遺傳異常相關(guān)。本研究，RAA 胎兒中22q11.2 微缺失綜合征的檢出率6.7%，與文獻報道一致。這些結(jié)果都表明，RAA 胎兒與22q11.2 綜合征有一定的相關(guān)性，即使沒有發(fā)現(xiàn)其他心內(nèi)外畸形，RAA 也可能與遺傳異常相關(guān)。MCELHINNEY等［6］報道22q11.2 微缺失在主動脈弓離斷檢出率50%，在永存主動脈干患者中檢出率為34.5%。D′ANTONIO 等［9］通過對16 項研究中的312 例RAA胎兒進行研究發(fā)現(xiàn)，RAA 胎兒的染色體異常發(fā)生率為6%～12.5%，22q11.2 微缺失發(fā)生率為2.4%～8.6%，與本研究RAA 的22q11.2 微缺失綜合征的發(fā)生率相近。本病例中，有一胎兒的9q31.2 處確定了個可能具有致病性的2.8 Mb 微缺失，該胎兒鼻骨發(fā)育不全，在Decipher 數(shù)據(jù)庫中有3 例具有微缺失區(qū)域重合，分別伴有室缺和胼胝體發(fā)育不全，這些缺失被定義為致病性，而在DGV 數(shù)據(jù)庫中無相同缺失片段收錄，因而認為胎兒的缺失為致病性的可能性大。另一胎兒6p21.3 微缺失其父親存在認知障礙。

GENG 等［10］應用CMA 檢測CHD 胎兒，對比孤立性冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（CHD）和非孤立性CHD 病例的檢出率，發(fā)現(xiàn)4.3%～9.3%孤立性胎兒存在致病或可能致病的拷貝數(shù)異常。在不包含非整倍體時，其檢出率高于非孤立性CHD。盡管孤立性的CHD 的致病性拷貝數(shù)變異檢出率不高，但當其合并心臟外畸形時，其致病性CNVs 的檢出率明顯增高［11］。通過本次研究，發(fā)現(xiàn)RAA 作為CHD 中的常見類型之一，當RAA 合并心臟外結(jié)構(gòu)異常時，CMA 檢出拷貝數(shù)異常率高于孤立性RAA胎兒。因此，當產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)心外畸形，會增加22q11.2 微缺失綜合征發(fā)生的可能性，尤其是胸腺發(fā)育不良，唇腭裂時，需要進一步評估［12］。本研究中的局限性，由于胎兒右位主動脈弓的較罕見性以及微陣列技術(shù)價格偏高、技術(shù)普及有限，因此研究樣本量較少，且是回顧性分析。本研究中檢出的CNVs 的臨床意義的清晰度也會隨時間推移而增加。通過對30 例RAA 胎兒的遺傳學檢測，產(chǎn)前診斷RAA 確定新的拷貝數(shù)異常的臨床意義，依舊具有挑戰(zhàn)性，也增加了產(chǎn)前遺傳咨詢的復雜性。

綜上所述，CMA 技術(shù)是對傳統(tǒng)的染色體核型分析的有效補充。通過使用CMA 技術(shù)可以有效提高染色體異常的檢出率，對染色體拷貝數(shù)異常的檢出更高更有效［13］。通過本研究，我們認為，當胎兒產(chǎn)前超聲診斷為RAA 時，應對胎兒進行微陣列分析的侵入性檢測。如果超聲檢出RAA 以外的結(jié)構(gòu)畸形的胎兒，其染色體異常的發(fā)生率會更高。