董建設(shè) 趙俊峰 張林超 陳瑞廷 賈占奎 楊錦建

(1河南省中醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科)

茯苓酸(PA)是中藥茯苓的有效活性物質(zhì)，屬于三萜類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化、止吐、抗癌等生物學(xué)作用〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，PA在乳腺癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤中起到抑制腫瘤增殖、侵襲和遷移的作用，PA抗腫瘤新藥研發(fā)領(lǐng)域在國(guó)內(nèi)外備受關(guān)注〔2～5〕。PA在抗腫瘤過(guò)程中具有多種途徑，可通過(guò)抑制磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白(PITPNM)3的磷酸化抑制乳腺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移〔6〕；通過(guò)下調(diào)蛋白激酶B(Akt)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2的磷酸化抑制Akt和ERK1/2信號(hào)通路的激活抑制膽囊癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和遷移，使膽囊癌細(xì)胞停滯在G1期〔7〕；在膀胱癌BIU87細(xì)胞中可通過(guò)誘導(dǎo)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3活性，上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá)，啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔8〕。Wnt信號(hào)通路參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為的過(guò)程〔9,10〕。目前關(guān)于PA對(duì)腎癌抑制作用的研究鮮有報(bào)道。本研究以人腎癌786-0細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察PA對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，并對(duì)其作用的分子機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料 人腎癌786-0細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；PA購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒購(gòu)于上海古朵生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)于北京萌壯科技有限公司；Wnt抗體、β-catenin抗體、Cyclin D1抗體、辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2腎癌786-0細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人腎癌786-0細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，細(xì)胞置于37℃、含5%體積分?jǐn)?shù)CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)良好的腎癌細(xì)胞接種于96孔板，每孔104個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，去除上清，加入含PA的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整PA終濃度分別為10、20、40、80 μg/ml，以不加PA正常培養(yǎng)的腎癌細(xì)胞為對(duì)照組，每組設(shè)置6個(gè)平行孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測(cè)腎癌細(xì)胞增殖抑制情況 各組細(xì)胞于37℃、100%濕度培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，每孔細(xì)胞中加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，放置于37℃條件下反應(yīng)4 h，去掉上清液，再在每孔中加入20 μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕混勻后，置于搖床上低速振蕩10 min，待結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。以對(duì)照組測(cè)得的A值為對(duì)照，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率百分比，細(xì)胞增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎癌細(xì)胞凋亡情況 培養(yǎng)24 h的各組腎癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌各組細(xì)胞2次，4℃條件下2 000 r/min離心5 min，加入200 μl的結(jié)合緩沖液混勻重懸細(xì)胞，用移液槍吹打成單細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μl PI混勻，置室溫下避光孵育15 min，待腎癌細(xì)胞結(jié)合Annexin V-FITC和PI后，在每個(gè)流式上樣管中加入不少于104個(gè)細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組腎癌細(xì)胞凋亡情況。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎癌細(xì)胞侵襲能力 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌細(xì)胞，饑餓處理24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，胰蛋白酶消化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，取200 μl細(xì)胞懸液接種到Transwell上室，取800 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基加入到下室，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用PBS洗滌3次，用4%的多聚甲醛固定20 min，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，再用PBS洗滌3次，在倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)，平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)表示腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎癌細(xì)胞遷移能力 先用標(biāo)記筆在6孔板背面均勻得劃?rùn)M線，橫線之間的距離約為1 cm，橫線需穿過(guò)孔。在每孔中加入約5×105/孔數(shù)量處理的腎癌細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜使之鋪滿培養(yǎng)皿底部，第2天用200 μl槍頭垂直于底部橫線做約為0.8 mm的劃痕，保證槍頭垂直，用PBS洗滌細(xì)胞3次，除去用槍頭劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。于 0、12、24 h取樣拍照，測(cè)量各組腎癌細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)遷移的距離。

1.7Western印跡檢測(cè)腎癌細(xì)胞中Wnt、β-catenin、Cyclin D1表達(dá)水平 各組腎癌細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h，消化后收集各組細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法對(duì)提取的蛋白濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%牛血清蛋白室溫封閉60 min，分別加入相應(yīng)的一抗Wnt(1∶800稀釋)、β-catenin(1∶800稀釋)、Cyclin D1(1∶1 000稀釋)4℃過(guò)夜孵育，再加入1∶2 000稀釋的二抗在室溫下孵育2 h。采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒進(jìn)行顯色，成像系統(tǒng)掃描，用軟件分析各組腎癌細(xì)胞中Wnt、β-catenin、Cyclin D1蛋白水平。

1.8Wnt信號(hào)通路激活劑對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡的影響 用Wnt信號(hào)通路激活劑20 mmol/L的氯化鋰(LiCl)處理40 μg/ml PA誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞，記為PA+LiCl組，40 μg/ml PA誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞作為對(duì)照，記為PA組，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)處理后24 h腎癌細(xì)胞凋亡率，步驟同1.4。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PA對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響 與0 μg/ml PA組相比，10、20、40、80 μg/ml組24、48、72 h腎癌細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(均P<0.05)。10、20、40 μg/ml組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，40、80 μg/ml組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。10、20、40、80 μg/ml組與前1時(shí)間點(diǎn)比較細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度PA對(duì)腎癌細(xì)胞增殖抑制率比較

與0 μg/ml組比：1)P<0.05；與10 μg/ml組比：2)P<0.05；與20 μg/ml組比：3)P<0.05；與同濃度下24 h比較：4)P<0.05；與同濃度下48 h比較：5)P<0.05

2.2PA對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡的影響 與0 μg/ml組相比，10、20、40、80 μg/ml腎癌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；20、40、80 μg/ml組與10 μg/ml組比較、40、80 μg/ml組與20 μg/ml組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，80 μg/ml組與40 μg/ml組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3PA對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 10、20、40、80 μg/ml組腎癌細(xì)胞遷移距離及穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比明顯減少(均P<0.05)，且呈濃度依賴性，隨PA濃度增加遷移距離及穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著減小(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度PA對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡率及侵襲、遷移的影響

與0 μg/ml組比較：1)P<0.05；與10 μg/ml組比較：2)P<0.05;與20 μg/ml組比較：3)P<0.05；與40 μg/ml組比較，4)P<0.05；下表同

2.4PA對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt、β-catenin、Cyclin D1的影響 0、10、20、40、80 μg/ml濃度組腎癌細(xì)胞Wnt、β-catenin、Cyclin D1水平組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖1、表3。

2.5Wnt信號(hào)通路激活劑對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡的影響 與PA組〔(43.35±4.11)%〕相比，PA+LiCl組腎癌細(xì)胞凋亡率明顯降低〔(25.18±2.14)%，P<0.05〕。

圖1 Western印跡檢測(cè)PA不同濃度組腎癌細(xì)胞中Wnt、β-catenin和Cyclin D1的表達(dá)水平

PA濃度(μg/ml)Wntβ-cateninCyclin D101.25±0.201.13±0.120.97±0.10100.94±0.101)0.89 ±0.101)0.77 ±0.071)200.68±0.071)2)0.60±0.071)2)0.55±0.041)2)400.41±0.041)2)3)0.38±0.041)2)3)0.30±0.031)2)3)800.27±0.021)2)3)4)0.24±0.021)2)3)4)0.18±0.021)2)3)4)

3 討 論

PA能夠顯著抑制前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)展，近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外研究抗腫瘤藥物的熱點(diǎn)〔11～13〕?？鼓[瘤活性與藥物能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤的轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔14,15〕。PA可呈濃度依賴性的抑制人前列腺癌LNCaP和DU145細(xì)胞增殖，這種對(duì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)是通過(guò)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)，以不同濃度的PA處理非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞后，低濃度的PA可抑制細(xì)胞侵襲能力，當(dāng)PA濃度到達(dá)30 mmol/L時(shí)可抑制細(xì)胞增殖，且以濃度依賴性的抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，PA可干擾線粒體膜電位促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡〔12〕。PA對(duì)4種人胰腺癌AsPc-1、BxPc-3、MiaPaca-2和Panc-1細(xì)胞系有不同程度的抑制作用，誘導(dǎo)多數(shù)胰腺癌細(xì)胞停滯于G0/G1期，此外，PA還可通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力〔17,18〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PA對(duì)腎癌細(xì)胞有顯著的細(xì)胞增殖抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴趨勢(shì)，當(dāng)PA濃度達(dá)到40 μg/ml時(shí)與80 μg/ml對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用變化不明顯，提示PA濃度為40 μg/ml時(shí)可能達(dá)到最大的細(xì)胞毒性；且PA可抑制腎癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PA下游調(diào)控因子及其作用的分子機(jī)制也被廣泛研究〔19〕。由丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞中核因子(NF)-κB被激活，經(jīng)PA處理后，可劑量依賴性的抑制NF-κB的激活，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。PA可通過(guò)調(diào)控CDKs和Cyclins等調(diào)控因子將腫瘤細(xì)胞阻滯于某一細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，起到抗癌作用〔3〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和ERK1/2信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲浸潤(rùn)等過(guò)程，PA可通過(guò)調(diào)控MAPK和ERK1/2信號(hào)通路抑制膽囊癌的發(fā)展〔7，20，21〕。PA通過(guò)調(diào)控Akt信號(hào)通路降低鼠病毒性心肌炎中心肌細(xì)胞的損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡〔22〕。研究表明，PA可通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路起到抗癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)PA處理的腎癌細(xì)胞中Wnt、β-catenin和Cyclin D1蛋白的表達(dá)量明顯降低，提示PA可抑制Wnt信號(hào)通路的激活；在40 μg/ml PA誘導(dǎo)是腎癌細(xì)胞中添加Wnt信號(hào)激活劑，發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞凋亡減少。PA通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路影響腎癌細(xì)胞凋亡。

PA抑制腎癌細(xì)胞增殖和侵襲，通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路的激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為腎癌的預(yù)防和治療提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。