呂應(yīng)年 梁言 葉華 劉義 吳科鋒 李立

(廣東醫(yī)科大學(xué)廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023)

在中國，肺癌發(fā)病率及致死率均高于其他癌癥〔1〕。大約87%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，大約70%的NSCLC確診時已是晚期，盡管治療手段已取得進(jìn)步，但預(yù)后仍不佳〔2〕。Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid(簡稱5F)是草藥半邊旗(Pteris semipinnata L.，PsL)的提取物，無論在體內(nèi)還是在體外都顯示出較好的抑癌效果并且毒副作用輕微〔3，4〕。本研究擬檢測5F對體外培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞株A549增殖活性的影響。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞 人源NSCLC細(xì)胞A549，由本實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。

1.2藥品 5F干粉由本實(shí)驗(yàn)室提供，采用丙二醇溶解并以蒸餾水稀釋，制成丙二醇體積分?jǐn)?shù)是0.15、5F質(zhì)量濃度是1 mg/ml的儲備液，然后除菌過濾、冷藏。實(shí)驗(yàn)時，再以培養(yǎng)基稀釋至所需的5F濃度(丙二醇最終濃度≤0.012)。

1.3試劑 新生牛血清(購于Hyclone)；RPMI1640培養(yǎng)基干粉、MTT及碘化丙啶(PI)(購于Sigma)；胰蛋白酶(購于Amresco)；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(購于dojindo)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、免疫印跡轉(zhuǎn)膜液、顯影定影試劑、發(fā)光液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑、細(xì)胞裂解液、GAPDH單克隆抗體、Survivin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(購于碧云天)；p53抗體(購于Santa Cruz)。

1.4儀器 YJ-875細(xì)胞操作臺(購于蘇州凈化設(shè)備廠)；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(購于Thermo)；垂直電泳儀(購于Bio-rad)；ELx800酶標(biāo)儀(購于BIO-TEK)；流式細(xì)胞儀(購于Beckmancoulter)；普通光學(xué)倒置顯微鏡(購于Nikon)。

1.5細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃、含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)A549細(xì)胞于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。

1.6MTT法檢測癌細(xì)胞存活率 當(dāng)A549細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積80%時，采用胰酶剝離細(xì)胞；細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)接種細(xì)胞，使每孔含有細(xì)胞2 000個。次日，以不同濃度5F處理細(xì)胞，然后培養(yǎng)細(xì)胞24、48或72 h；添加MTT(MTT終濃度為0.5 mg/ml)并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后棄培養(yǎng)液，每孔加100 μl的二甲基亞砜(DMSO)，搖勻后再采用酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處的吸光度，計算癌細(xì)胞的存活率。另外，在5F處理24 h的時間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

1.7流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 A549細(xì)胞鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積80%時，以胰酶剝離細(xì)胞，并于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)接種細(xì)胞，保證每孔含細(xì)胞105個。次日，以不同濃度的5F處理細(xì)胞；24 h后，采用胰酶剝離細(xì)胞，離心后以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌；再離心后丟棄上清，采用70%的酒精固定細(xì)胞，置于4℃并過夜；離心后以PBS洗滌，丟棄上清，以50 μg/ml的PI染色，采用流式細(xì)胞儀并按試劑盒說明書檢測細(xì)胞周期。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 A549鋪滿培養(yǎng)瓶底面積80%時，以胰酶剝離細(xì)胞，于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)接種細(xì)胞，保證每孔含細(xì)胞105個。次日，以不同濃度5F處理細(xì)胞。24 h后，采用流式細(xì)胞儀并按試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡。

1.9免疫印跡檢測p53及Survivin蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。次日，以不同濃度5F處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，并提取蛋白、測定濃度。進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜并采用脫脂奶封閉2 h，加p53(1∶200)或Survivin(1∶400)抗體，4℃孵化過夜；洗膜并添加二抗，室溫孵化2 h；洗膜后曝光并顯影，采用Quantity One軟件進(jìn)行目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的分析。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS 12.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.15F對A549增殖活性的影響 MTT結(jié)果表明，5F處理無論是24、48 h或72 h，在5～80 μg/ml范圍內(nèi)均可顯著抑制A549細(xì)胞增殖，且抑制效果隨著5F濃度的增加而增強(qiáng)，呈劑量依賴關(guān)系。同時，在5F濃度相同的情況下，隨著處理時間延長，其抗癌效果也增強(qiáng)，呈時間依賴關(guān)系，見圖1。

2.25F對A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 在空白對照組(5F 0 μg/ml)，A549細(xì)胞增殖迅速并密布細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，雖然細(xì)胞過多導(dǎo)致相互擠壓但無細(xì)胞脫壁現(xiàn)象發(fā)生。隨著5F濃度提高，A549細(xì)胞增殖活性逐漸下降且貼壁能力逐漸降低，且有細(xì)胞脫落懸浮，并可見部分細(xì)胞體積變小、變圓。見圖2。

與0 μg/ml比較：1)P<0.01，2)P<0.001圖1 5F對細(xì)胞存活的影響

圖2 5F對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(×100)

2.35F對A549細(xì)胞周期進(jìn)程的影響 5F處理能夠?qū)е翧549細(xì)胞周期發(fā)生改變，具體表現(xiàn)為G2期細(xì)胞比例顯著增多，且該G2期阻滯作用隨著5F濃度的增加而增強(qiáng)即呈劑量依賴關(guān)系(P<0.001)，而20 μg/ml及40 μg/ml的5F處理甚至能夠使G2期細(xì)胞比例提高數(shù)倍。見表1。

2.45F對A549細(xì)胞凋亡水平的影響 5F處理24 h可顯著提高A549細(xì)胞凋亡發(fā)生水平，且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.001)，特別是在5F濃度為20 μg/ml及40 μg/ml時，A549細(xì)胞凋亡率均出現(xiàn)了數(shù)倍的大幅度上調(diào)，提示5F具有誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡的活性。見表1。

2.55F對A549細(xì)胞內(nèi)p53及Survivin蛋白表達(dá)的影響 5F處理24 h導(dǎo)致A549細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)顯著提高，即隨著5F濃度的增加p53蛋白表達(dá)面積及灰度逐漸擴(kuò)大并增強(qiáng)且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.001)，而Survivin蛋白表達(dá)則隨著5F濃度的增加而逐漸下調(diào)并呈劑量依賴關(guān)系(P<0.001)，見表1，圖3。

表1 5F對A549細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及p53、Survivin蛋白表達(dá)的影響

與0 μg/ml 5F組比較：1)P<0.01，2)P<0.001；與10 μg/ml 5F組比較：3)P<0.001

圖3 5F對p53及Survivin蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

本研究結(jié)果表明，5F可顯著抑制NSCLC細(xì)胞株A549的增殖活性，并且呈劑量、時間依賴關(guān)系，提示5F具有較好的抗癌效果。

細(xì)胞周期失控及細(xì)胞凋亡的逃避是癌細(xì)胞標(biāo)志性特征〔5〕。因此，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程可能是一個有效抗癌策略。5F已被證明能夠阻滯結(jié)腸癌細(xì)胞C26、鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z、肺癌細(xì)胞NCI-H23及CRL-2066于G2期〔3，4，6〕。與上述報道相似，本研究顯示5F可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯。P53激活能夠?qū)е录?xì)胞發(fā)生G2期阻滯，其機(jī)制在于p53靶基因p21可通過抑制cyclin B/Cdc2阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程；另外，其他的p53靶基因如14-3-3σ也可能參與阻斷G2期轉(zhuǎn)換〔7〕。鑒于此，本文檢測了A549細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)，以期進(jìn)一步調(diào)查5F介導(dǎo)的細(xì)胞G2期阻滯發(fā)生原因。結(jié)果顯示，5F處理能夠顯著提高A549細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)，并呈劑量依賴關(guān)系，表明5F誘導(dǎo)的細(xì)胞周期G2期阻滯可能涉及p53激活。

先前的報道顯示，一些抗癌劑如順鉑能夠抑制G2期進(jìn)程并伴隨細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔8〕。通過細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡是抗癌劑的主要機(jī)制。在本研究中，Annexin V-FITC染色結(jié)果顯示5F誘導(dǎo)了A549發(fā)生細(xì)胞凋亡，該結(jié)果與我們先前研究5F誘導(dǎo)其他癌細(xì)胞發(fā)生凋亡所獲結(jié)果一致〔3,4,6,9～11〕。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族重要成員之一，幾乎在所有的人類腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，但在大多數(shù)的、已分化的正常組織中卻罕有表達(dá)，因此被認(rèn)為是癌特異性標(biāo)志物〔12〕。Survivin能夠通過眾多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，干擾細(xì)胞凋亡進(jìn)程、促進(jìn)腫瘤傳播，并賦予腫瘤細(xì)胞治療逃避的特性。在本研究中，5F處理導(dǎo)致Survivin蛋白表達(dá)下調(diào)，提示5F誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能與Survivin抑制有關(guān)。此外，5F誘導(dǎo)的p53上調(diào)也可能參與了上述細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因?yàn)閜53除了調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程外，還能夠通過轉(zhuǎn)錄依賴方式或非轉(zhuǎn)錄依賴方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕。

綜上所述，5F能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞A549增殖，該抑制效果與細(xì)胞周期G2期阻滯及細(xì)胞凋亡有關(guān)，并可能涉及p53蛋白上調(diào)及Survivin蛋白下調(diào)。