鄭麗莉

(山東協(xié)和學(xué)院醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250109)

心肌梗死(簡稱心梗)是我國目前致死率較高的疾病之一，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)〔1〕。梗死區(qū)內(nèi)的血管再生或重新開放對(duì)心肌細(xì)胞的存活具有至關(guān)重要的作用，而單靠自然性血管新生，其過程極為緩慢，且只能代償部分心肌功能。因此，治療性血管新生即“分子搭橋術(shù)”，成為目前心梗治療的新途徑，該方法通過藥物治療促進(jìn)缺血心肌微血管形成和冠狀動(dòng)脈分支或側(cè)支循環(huán)的建立，能改善血供，促進(jìn)心肌修復(fù)。

冠心病屬于中醫(yī)學(xué)胸痹范疇，病機(jī)主要為心陽虛兼痰濕內(nèi)阻，瘀血阻絡(luò)。六君子源于《醫(yī)學(xué)正傳》，芎歸六君子湯以之為基礎(chǔ)，增加當(dāng)歸和川芎活血補(bǔ)血，臨床常用于治療脾胃不足、痰瘀阻絡(luò)者。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，冠心病與脾胃具有相關(guān)性；芎歸六君子湯能調(diào)理脾胃運(yùn)化功能，改善胃腸道激素和三磷酸腺苷(ATP)酶的水平，促進(jìn)梗死心肌邊緣微血管再生，改善梗死后的心功能、血流動(dòng)力學(xué)，減少梗死面積〔2〕。本研究進(jìn)一步分析芎歸六君子湯對(duì)心肌梗死大鼠外周血粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)含量、心梗邊緣血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)表達(dá)的影響，探討通過改善脾胃功能促進(jìn)缺血心肌微血管再生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體重(200±20)g，SPF級(jí)，購自濟(jì)南市朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，合格證編號(hào)SCXK(魯)20140007。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1中藥材 各單味中藥材由建聯(lián)藥店提供，山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定。人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、姜半夏、陳皮、當(dāng)歸、川芎按比例3∶3∶3∶2∶2∶1∶3∶3稱取，煎煮3次后混合，60℃水浴箱濃縮，滅菌，每毫升制劑含0.63 g生藥。

1.2.2對(duì)照藥 消心痛，國藥準(zhǔn)字H19991039，魯南貝特制藥公司提供。復(fù)方丹參滴丸，國藥準(zhǔn)字Z10950111，天津天士力制藥公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)器材 C201型動(dòng)物呼吸機(jī)(四川成都儀器廠)；Synergy2 酶標(biāo)儀 (美國伯騰儀器公司)；PE4800 PR 循環(huán)儀(美國PE公司)；鏑-型電泳儀、凝膠成分分析系統(tǒng)(美國Bio-拉德公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)試劑 G-CSF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，購自上海喬羽生物科技有限公司。兔抗-bFGF，批號(hào)BA0259；兔抗-VEGF，批號(hào)BA0407；鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增試劑盒、瓊脂糖、DNA-Mark均由上海生物工程有限公司提供。

1.5方法

1.5.1動(dòng)物分組及給藥方法 將大鼠60只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、消心痛組、復(fù)方丹參滴丸組和芎歸六君子湯組，每組12只。各組分別以等效劑量灌胃生理鹽水10 ml/kg、生理鹽水10 ml/kg、消心痛4.2 mg/kg、復(fù)方丹參滴丸85 mg/kg、芎歸六君子湯6.3 g/kg，1次/d，共28 d。

1.5.2模型制備 動(dòng)物麻醉，固定，仰臥位，氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，描記Ⅱ?qū)?lián)心電圖。常規(guī)備皮、消毒，胸部2～3肋間偏左4～5 mm處切開，剪開心包，暴露心臟，穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。線下心臟跳動(dòng)減弱，顏色變白，心電圖顯示ST段弓背抬高明顯，說明結(jié)扎成功〔3〕。假手術(shù)組不結(jié)扎只穿線。術(shù)后，青霉素40萬單位肌注3 d，預(yù)防感染。

1.5.3檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.3.1血清G-CSF檢測(cè) 下腔靜脈取血，離心，取血清，ELISA法檢測(cè)血清G-CSF水平，具體操作參照試劑盒說明書。

1.5.3.2心梗邊緣區(qū)組織VEGF、bFGF蛋白表達(dá)的測(cè)定 取心肌組織，包括心肌梗死區(qū)、移行區(qū)、健存區(qū)，免疫組織化學(xué)法染色組織切片。兔抗鼠bFGF、VEGF多克隆抗體的工作濃度為1∶100，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，bFGF、VEGF蛋白表達(dá)以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性反應(yīng)。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野，采用圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算梗死心肌邊緣染色陽性的OD值，取其均值即為MOD(平均光密度)。MOD與各因子蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。

1.5.3.3心梗邊緣區(qū)組織VEGF、bFGF mRNA測(cè)定 取出心臟，取梗死區(qū)邊緣存活心肌50 mg，加1 ml Trizol冰上勻漿，采用Omega公司總RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取。取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系(20 μl)∶cDNA 1 μl，10×Taq緩沖液(含 Mg2+)1.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.2 μl，5 U/μl Taq 酶 0.2 μl，上、下游引物各0.3 μl，加DEPC水至20 μl，震蕩混勻，置PCR儀擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s；退火；72℃延伸45 s，終末延伸10 min，循環(huán)35個(gè)。PCR引物退火溫度及產(chǎn)物長度見表1。1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，凝膠成像分析，掃描條帶，測(cè)定各泳道樣品光密度值，β-actin 為內(nèi)參照基因，計(jì)算目標(biāo)基因與β-actin光密度比值，以此值反映各樣品中VEGF及bFGF mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 待測(cè)基因引物序列退火溫度及產(chǎn)物長度

1.6統(tǒng)計(jì)方法 運(yùn)用SPSS21.0軟件，多組均數(shù)的比較行單因素方差分析，兩兩比較行最小顯著差法。

2 結(jié) 果

2.1各組G-CSF水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組GSF含量顯著升高(P<0.01)，說明心梗后出現(xiàn)了自發(fā)性G-CSF增加。與模型組相比，各給藥組G-CSF水平明顯增加，其中芎歸六君子湯組效果最好(P<0.01)。見表2。

2.2各組心梗邊緣區(qū)VEGF、bFGF蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組VEGF、bFGF蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組VEGF、bFGF升高顯著(P<0.01)，且以芎歸六君子湯組升高最顯著 (P<0.01)。見表2。

2.3各組心梗邊緣區(qū)VEGF、bFGF mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組VEGF、bFGF mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組VEGF、bFGF mRNA含量顯著升高(P<0.01)，且以芎歸六君子湯組升高最明顯，與其他給藥組相比有顯著性差異(P<0.01)。見表2。

表2 各組血清G-CSF水平和心梗邊緣組織VEGF、bFGF蛋白及mRNA表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01；與消心痛組比較:3)P<0.01；與復(fù)方丹參滴丸組比較:4)P<0.01

3 討 論

心梗是冠狀動(dòng)脈閉塞，血流中斷，部分心肌因嚴(yán)重的持久性缺血而發(fā)生局部壞死。心梗后引起的炎癥反應(yīng)，可動(dòng)員造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)和間充質(zhì)細(xì)胞等少量骨髓干細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，并向梗死區(qū)和血管損傷處遷移，一則抑制淋巴細(xì)胞增殖活化，從而抑制免疫炎癥反應(yīng)；二則分化成為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)心肌細(xì)胞和新生血管的形成，使梗死心肌的結(jié)構(gòu)和功能得到修復(fù)。細(xì)胞因子G-CSF、VEGF、bFGF等均能動(dòng)員進(jìn)入外周血和受損組織。G-CSF可調(diào)節(jié)宿主心肌細(xì)胞的微環(huán)境和自分泌，上調(diào)缺血心肌血管活性生長因子如 VEGF的表達(dá)，不僅能使外周血中EPC和造血干細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，還可以動(dòng)員其遷移至損傷心肌，并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生，增加側(cè)支循環(huán)〔4〕。G-CSF可以上調(diào)心肌梗死區(qū)凋亡抑制基因Bc1-2表達(dá)，抑制凋亡誘導(dǎo)基因如P53和FasL的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，修復(fù)心肌細(xì)胞，改善心梗后心臟功能〔5〕。

心梗后會(huì)引起缺血心肌的自發(fā)性微血管新生。自發(fā)性血管新生耗時(shí)長，數(shù)量少，難以建立有效的側(cè)支循環(huán)。治療性血管再生可促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)的建立和開放，為缺血心肌提供血供，減少心肌細(xì)胞的壞死和凋亡，有效改善心功能，因此成為心梗治療的研究熱點(diǎn)。血管新生是一個(gè)復(fù)雜的高度受控的過程，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移是基礎(chǔ)性環(huán)節(jié)，多種內(nèi)皮細(xì)胞生長因子參與其中。VEGF、bFGF為體內(nèi)最有效的促血管因子，可促進(jìn)血管新生、側(cè)支循環(huán)形成及心肌細(xì)胞再生。VEGF 與其受體(VEGFR)-1結(jié)合，在核酸和蛋白水平誘導(dǎo)纖溶酶原激活物的表達(dá)，降解細(xì)胞外蛋白和基膜，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，蛋白外滲，加快內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，為血管新生提供基質(zhì)支撐〔6〕。VEGF 與其受體VEGFR-2結(jié)合后，激活絲裂原活化的蛋白激酶，引起受體自身磷酸化，實(shí)現(xiàn) VEGF 的絲裂原特性，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)新生血管生成〔7〕。心肌在缺血狀態(tài)下能夠分泌bFGF，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶和纖溶酶原激活物，降解基底膜，誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)；同時(shí)，bFGF受體RNA合成增加，受體數(shù)目上調(diào)，使bFGF的作用進(jìn)一步加強(qiáng)〔8〕。與VEGF不同的是，bFGF對(duì)微血管側(cè)支和動(dòng)脈性側(cè)支的生長都有促進(jìn)作用〔9〕。

本研究結(jié)果顯示，芎歸六君子湯組能顯著提高外周血G-CSF含量，改善梗死心肌邊緣VEGF和bFGF的蛋白和基因表達(dá)，說明芎歸六君子湯能促進(jìn)心梗大鼠微血管新生，改善心功能，其機(jī)制可能為：促進(jìn)G-CSF分泌，動(dòng)員骨髓干細(xì)胞向梗死灶遷移和分化；增加促血管因子VEGF、bFGF分泌，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、趨化和遷移。

心梗屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇，其病機(jī)以氣虛為本，痰凝瘀阻為標(biāo)。芎歸六君子湯以四君子湯配伍川芎、當(dāng)歸而成。脾胃為后天之本，氣血生化之源，心之氣血稟受于中焦脾胃。四君子湯具有補(bǔ)氣健脾之效，脾胃健運(yùn)，氣血化生有源，能增加心肌血供；加味半夏、陳皮化痰消脂，改善血管硬化、脂質(zhì)沉積；加味川芎、當(dāng)歸補(bǔ)血活血，既能祛瘀行滯，改善血管淤滯，又可促血化生，改善心肌缺血。八藥合參，共奏補(bǔ)氣健脾、化痰活血之效，能有效改善心梗患者的血液淤滯、血供不足問題，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。本研究結(jié)果同時(shí)提示改善脾胃功能有助于改善心肌缺血，說明脾胃和心臟可能存在一定的相關(guān)性。關(guān)于芎歸六君子湯對(duì)G-CSF和促血管因子的影響，是否同時(shí)存在對(duì)下游信號(hào)通路如胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)的影響，及各靶點(diǎn)之間是否存在相互作用，有待下一步研究予以闡釋。