羅緒 羅麗丹 尚獻(xiàn)會(huì)

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，貴州 遵義 563000；2遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校；3遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒外科)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，近些年發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)〔1〕。腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡不平衡是其發(fā)生發(fā)展的重要因素。有效誘導(dǎo)腫瘤凋亡成為腫瘤治療的一個(gè)新方法。獼猴桃根具有抗癌、健胃、活血消腫等多種功效，其提取物對(duì)腫瘤具有抑制作用。研究顯示，獼猴桃根提取物可通過(guò)抑制信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3降低肝癌進(jìn)展〔2〕；獼猴桃根多糖(ACPS)可抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)〔3〕，這提示獼猴桃根在腫瘤中有重要作用。但ACPS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響還未明確。Wnt信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中過(guò)度激活〔4,5〕。研究顯示，抑制Wnt信號(hào)通路可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制增殖〔6〕。ACPS是否可調(diào)控Wnt信號(hào)通路影響結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性還未明確。本研究檢測(cè)ACPS或Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV-939對(duì)HT29細(xì)胞活力和凋亡的影響，以期為結(jié)腸癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；β-catenin、cyclinD1、survivin抗體均購(gòu)自美國(guó)CST；XAV-939購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aadrich；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)及流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)8購(gòu)自上海碧云天；酶標(biāo)儀購(gòu)自日本Hitech。

1.2CCK8檢測(cè)ACPS對(duì)HT29細(xì)胞活力的影響 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HT29細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，并將濃度調(diào)整為5×104/ml，接種于96孔板，每孔中加入200 μl的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h以進(jìn)行同步化處理，加入終濃度0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml的ACPS，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照組中不加入藥物，空白組不加入細(xì)胞，均加入100 μl培養(yǎng)液，于培養(yǎng)24、48和72 h加入CCK8溶液，均加入100 μl，孵育2 h，在450 nm處，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值(A值)。A值可間接反映細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3ACPS調(diào)控Wnt信號(hào)通路對(duì)HT29細(xì)胞活力的影響 HT29細(xì)胞分為四組，即陰性對(duì)照組、ACPS組(4.00 mg/ml的ACPS處理細(xì)胞)、XAV-939組(10 μmol/L的XAV-939處理細(xì)胞)和ACPS+XAV-939組(4.00 mg/ml的ACPS和10 μmol/L的XAV-939處理細(xì)胞)。以5×104/ml濃度接種HT29細(xì)胞于96孔板，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h后按照上述分組處理細(xì)胞，于處理后48 h參照1.2方法檢測(cè)各組細(xì)胞A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4ACPS調(diào)控Wnt信號(hào)通路對(duì)HT29細(xì)胞凋亡的影響 收集按照1.3分組處理48 h的4組細(xì)胞，胰酶消化及磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，400 μl的1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入 5 μl Annexin V-FITC，混合均勻后避光孵育15 min，再加入PI 10 μl，混合均勻后避光孵育5 min，1 h內(nèi)上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Western印跡 收集按照1.3分組處理48 h的4組細(xì)胞，加入100 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解液提取總蛋白，蛋白定量后，取總蛋白等量(40 μg)，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)好的膜用5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的一抗(β-catenin、cyclinD1、survivin及內(nèi)參β-actin)，4℃過(guò)夜，加入1∶1 000稀釋的二抗〔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記〕，室溫孵育1 h，洗膜，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，顯影后，以β-actin為內(nèi)參蛋白，通過(guò)凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白相對(duì)于β-actin蛋白的光密度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ACPS對(duì)HT29細(xì)胞活力的影響 0.25 mg/ml和0.50 mg/ml的ACPS對(duì)HT29細(xì)胞活力影響與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24 h：P>0.05)，而1.00～4.00 mg/ml的ACPS在24～72 h均能降低HT29細(xì)胞活力，與陰性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有濃度依賴(lài)性，各濃度均呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 ACPS對(duì)HT29細(xì)胞活力的影響

與陰性對(duì)照組比較：1)P<0.05；與24 h比較：2)P<0.05

2.2ACPS調(diào)控Wnt信號(hào)通路對(duì)HT29細(xì)胞活力的影響 ACPS和XAV-939均能抑制HT29細(xì)胞活力(0.635±0.047，0.718±0.055)，與陰性對(duì)照組(1.262±0.068)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞活力抑制作用更明顯(0.431±0.036)，且與ACPS和XAV-939組細(xì)胞活力比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=135.422，P=0.000)。

2.3ACPS調(diào)控Wnt信號(hào)通路對(duì)HT29細(xì)胞凋亡的影響 ACPS和XAV-939均能誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡(13.44%±0.39%、10.12%±0.31%)，與陰性對(duì)照組(2.31%±0.16%)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更明顯(18.85%±0.54%)，且與ACPS和XAV-939組細(xì)胞凋亡率比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 016.887，P=0.000)。見(jiàn)圖1。

圖1 ACPS調(diào)控Wnt信號(hào)通路對(duì)HT29細(xì)胞活力的影響

2.4ACPS對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 ACPS和XAV-939均能抑制β-catenin、cyclinD1和survivin蛋白表達(dá)，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者聯(lián)合對(duì)β-catenin、cyclinD1和survivin蛋白表達(dá)抑制作用更明顯，且與ACPS和XAV-939組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 ACPS對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別β-catenincyclinD1survivin陰性對(duì)照組0.741±0.0580.321±0.0350.198±0.023ACPS組0.256±0.0281)2)0.156±0.0181)2)0.085±0.0101)2)XAV-939組0.339±0.0341)2)0.204±0.0211)2)0.119±0.0141)2)ACPS+XAV-939組0.134±0.0150.097±0.0110.031±0.006F值149.95051.31468.194P值0.0000.0000.000

3 討 論

我國(guó)中藥資源比較豐富，中藥中有效活性成分在結(jié)腸癌治療中發(fā)揮重要作用。如黃芪多糖、靈芝多糖均可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡〔7,8〕。獼猴桃根為獼猴桃科植物獼猴桃的根或根皮，目前已證實(shí)從根莖中提取的多糖復(fù)合物或多糖、三萜類(lèi)化合物等具有多種生物活性，且在一些地區(qū)用于抗癌的佐劑。如獼猴桃根三萜類(lèi)化合物及ACPS均可抑制胃癌增殖和促進(jìn)凋亡〔9〕。本研究結(jié)果與Song等〔3〕研究ACPS對(duì)胃癌細(xì)胞增殖影響的趨勢(shì)是一致的。ACPS對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響可能是通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。

Wnt信號(hào)通路異常激活與結(jié)直腸癌、肺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，Wnt/β-catenin為經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路。當(dāng)Wnt信號(hào)受到刺激時(shí)，其配體和受體結(jié)合，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin蛋白積累，進(jìn)入細(xì)胞核，并結(jié)合細(xì)胞因子(TCF)/淋巴增強(qiáng)因子(LEF)激活cyclinD1、c-myc等下游靶基因，進(jìn)而影響腫瘤生物學(xué)特性〔10,11〕。有研究顯示，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可降低包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展〔12〕。XAV-939為Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑，可抑制多種腫瘤生長(zhǎng)〔13,14〕。cyclinD1為調(diào)控細(xì)胞周期的因子，可對(duì)細(xì)胞增殖及周期完成起促進(jìn)作用，在結(jié)腸癌中表達(dá)升高，其表達(dá)升高與結(jié)腸癌預(yù)后、臨床分期等密切相關(guān)〔15〕。Survivin也是Wnt信號(hào)通路的下游靶基因，為凋亡抑制基因，結(jié)腸癌中表達(dá)升高，抑制其表達(dá)可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡〔16〕。有研究發(fā)現(xiàn)，XAV-939可通過(guò)調(diào)控cyclinD1和survivin表達(dá)抑制結(jié)腸癌發(fā)展〔17,18〕。綜上，ACPS可能通過(guò)下調(diào)Wnt信號(hào)抑制結(jié)腸癌增殖和誘導(dǎo)凋亡。