黃春華 韋玲芝 鐘良 饒旺福

(江西中醫(yī)藥大學 1附屬醫(yī)院腦病科，江西 南昌 330006；2研究生院)

腦缺血的發(fā)生與腦組織中氧化應激、炎癥反應、興奮性氨基酸過度釋放等有關，其中氧化應激是誘發(fā)缺血性腦損傷的重要原因之一〔1〕。腦缺血損傷的發(fā)生與膠質細胞損傷有關，星形膠質細胞是神經(jīng)血管單元的組成部分，也是膠質細胞中體積最大的一種細胞，其在缺血損傷中發(fā)揮關鍵作用〔2〕。天麻素在臨床上常用于治療眩暈癥、神經(jīng)元炎癥等疾病，天麻素是一種從天麻根中提取出來的有效成分，能夠改善老年癡呆大鼠的記憶功能，減少海馬神經(jīng)元毒性〔3～5〕。研究表明，天麻素能夠降低脂多糖(LPS)誘導的星形膠質細胞凋亡水平，發(fā)揮星形膠質細胞保護作用〔6〕。本實驗以明確天麻素對減輕缺氧缺糖星形膠質細胞氧化損傷為研究目的，用天麻素處理缺氧缺糖星形膠質細胞損傷模型，以期為天麻素治療腦缺血神經(jīng)損傷提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 6只出生2 d內(nèi)的C57BL/6新生乳鼠由江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供；活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-9抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、Cleaved Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology；細胞色素(Cyt)C抗體購自美國Sigma-Aldrich；辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Santa Cruz；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce；電化學發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Millipore；天麻素購自上海純優(yōu)生物科技有限公司，天麻素溶解于去離子滅菌水中，保存在-20℃；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成；JC-1法線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海容創(chuàng)生物技術有限公司。

1.2星形膠質細胞分離培養(yǎng) 參照文獻〔7〕，取出生2 d的新生乳鼠，置于75%的乙醇中消毒，以D-Hanks液洗滌后，于顯微鏡下將大腦組織取出，用鑷子將血管膜剔除后，取出大腦皮層組織，剪碎，加入0.125%的胰蛋白酶，置于37℃中消化15 min。添加含有青鏈霉素的10%胎牛血清的DMEM，轉移到離心管中，1 200 r/min離心10 min，把上清溶液棄掉，用200目濾網(wǎng)過濾。1×106個/ml細胞數(shù)種植到75 mm2的培養(yǎng)瓶中，每隔3 d進行換液處理，培養(yǎng)至第9天，把細胞放在37℃的搖床上，以240 r/min孵育18 h，以細胞培養(yǎng)液將細胞培養(yǎng)面洗滌2次，添加0.25%的胰蛋白酶消化后，種植到細胞培養(yǎng)瓶中。取第3代星形膠質細胞進行后續(xù)實驗。

1.3細胞分組和模型構建 缺氧缺糖模型構建：星形膠質細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌以后，添加不含糖的DMEM，將細胞轉移到缺氧缺糖裝置中，充入缺氧氣體(5% CO2和95%N2)5 min。再把缺氧缺糖裝置轉移到37℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

星形膠質細胞分為5組，分別為對照組、模型組、天麻素低、中、高劑量組，模型組、天麻素低、中、高劑量組細胞按照上述方法給予缺氧缺糖處理，其中天麻素低、中、高劑量組細胞在缺氧缺糖處理前2 h分別給予含10、20、40 μmol/L的天麻素細胞培養(yǎng)液預處理。對照組不做缺氧缺糖處理，不給予天麻素預處理。

1.4細胞增殖檢測 星形膠質細胞接種到96孔板內(nèi)，接種密度為2×104個/ml，每個孔中加入100 μl的細胞懸浮液，按照對照組、模型組、天麻素低、中、高劑量組分組處理，缺氧缺糖處理培養(yǎng)8 h以后，在每個孔中加入20 μl的噻唑藍(MTT)溶液，置于37℃孵育4 h。棄去上清溶液，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩反應10 min后，檢測490 nm的OD值，以不含細胞的孔調(diào)零，以對照組細胞的存活率為100%，分析各組細胞存活率變化情況。

1.5LDH漏出率檢測 星形膠質細胞以每個孔中加入1×106個細胞接種到12孔板中，培養(yǎng)24 h以后，細胞生長密度為90%左右，按照對照組、模型組、天麻素低、中、高劑量組分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)8 h。收集上清溶液作為培養(yǎng)液樣品。用1%的Triton X-100將細胞裂解30 min，收集裂解液離心后，收集上清作為細胞裂解樣品。用LDH含量測定試劑盒檢測培養(yǎng)液樣品和細胞裂解樣品的OD值。LDH漏出率=100%×培養(yǎng)液樣品OD值/(培養(yǎng)液樣品OD值+細胞裂解樣品OD值)

1.6細胞凋亡檢測 各組按照1.3方法處理以后，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，以提前預冷的PBS把細胞洗滌2次，用400 μl結合緩沖液將細胞沉淀懸浮以后，添加5 μl碘化丙啶(PI)、5 μl膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，把細胞放在避光條件下反應20 min，再在細胞懸浮液中加入100 μl緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.7Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平檢測 各組按照1.3方法處理以后，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，把上清吸除，添加1% 苯甲基磺酞氟(PMSF)蛋白裂解液，將細胞放置于冰上，孵育30 min。吸取上清液，置于-20℃保存。以BCA法檢測蛋白濃度。常規(guī)方法制膠，蛋白在上樣前進行變性處理(與等體積上樣緩沖液混合后置于100℃孵育5 min)。把凝膠取出，設置30 mA電流進行轉膜，轉膜置于冰水混合物上進行，轉膜時間為90 min，蛋白被轉移到硝酸纖維素(NC)膜上。NC膜放在5%牛血清白蛋白中，在室溫條件孵育1 h。再將膜放在1∶400稀釋的Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗，1∶600稀釋的Bax一抗中，置于4℃孵育過夜以后，將NC膜置于含1∶3 000稀釋的二抗中，在室溫中孵育2 h。以ECL發(fā)光，Image J分析條帶灰度值，內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

1.8線粒體膜電位檢測和胞質中CytC蛋白水平檢測 各組細胞按照1.3方法處理，培養(yǎng)8 h。用JC-1法檢測線粒體膜電位，步驟同試劑盒說明書。同時收集各組細胞，提取細胞胞質中的蛋白，用Western印跡方法檢測CytC蛋白水平，步驟同上。

1.9統(tǒng)計學分析 應用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞存活率比較 模型組及天麻素低、中、高劑量組存活率均顯著低于對照組(P<0.05)。天麻素低、中、高劑量組存活率均顯著高于模型組(P<0.05)。天麻素中、高劑量組存活率均顯著高于天麻素低劑量組(P<0.05)。天麻素高劑量組存活率顯著高于天麻素中劑量組(P<0.05)。見表1。

2.2各組LDH漏出率比較 模型組及天麻素低、中、高劑量組LDH漏出率均顯著高于對照組(P<0.05)。天麻素低、中、高劑量組LDH漏出率均顯著低于模型組(P<0.05)。天麻素中、高劑量組LDH漏出率均顯著低于天麻素低劑量組(P<0.05)。天麻素高劑量組LDH漏出率顯著低于天麻素中劑量組(P<0.05)。見表1。

2.3各組細胞凋亡率比較 模型組及天麻素低、中、高劑量組凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)。天麻素低、中、高劑量組凋亡率均顯著低于模型組(P<0.05)。天麻素中、高劑量組凋亡率均顯著低于天麻素低劑量組(P<0.05)。天麻素高劑量組凋亡率顯著低于天麻素中劑量組(P<0.05)。見表1、圖1。

2.4各組Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達水平比較 模型組及天麻素低、中、高劑量組Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均顯著高于對照組(P<0.05)。天麻素低、中、高劑量組Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均顯著低于模型組(P<0.05)。天麻素中、高劑量組Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均顯著低于天麻素低劑量組(P<0.05)。天麻素高劑量組Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平顯著低于天麻素中劑量組(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 各組存活率、LDH漏出率、凋亡率及細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平比較

與對照組比：1)P<0.05；與模型組比：2)P<0.05；與天麻素低劑量組比：3)P<0.05；與天麻素中劑量組比：4)P<0.05；表2同

圖1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡

1～5：對照組，模型組，天麻素低劑量組，天麻素中劑量組，天麻素高劑量組；圖3同圖2 Western印跡檢測各組Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平

2.5各組粒體膜電位及CytC蛋白水平比較 模型組及天麻素低、中、高劑量組CytC蛋白水平均顯著高于對照組(P<0.05)，線粒體膜電位熒光強度均顯著低于對照組(P<0.05)。天麻素低、中、高劑量組CytC蛋白水平均顯著低于模型組(P<0.05)，線粒體膜電位熒光強度均顯著高于模型組(P<0.05)。天麻素中、高劑量組CytC蛋白水平均顯著低于天麻素低劑量組(P<0.05)，線粒體膜電位熒光強度均顯著高于天麻素低劑量組(P<0.05)。天麻素高劑量組CytC蛋白水平顯著低于天麻素中劑量組(P<0.05)，線粒體膜電位熒光強度顯著高于天麻素中劑量組(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 Western印跡檢測各組CytC蛋白水平

組別CytC線粒體膜電位(熒光強度)對照組0.20±0.03160.89±12.63模型組0.79±0.071)78.56±6.321)天麻素低劑量組0.51±0.031)2)99.89±9.671)2)天麻素中劑量組0.39±0.021)2)3)118.78±8.761)2)3)天麻素高劑量組0.31±0.031)2)3)4)139.36±8.201)2)3)4)F/P值95.813/0.00035.777/0.000

3 討 論

星形膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，其可以分為纖維性星形膠質細胞、原漿性星形膠質細胞，星形膠質細胞作為一種填充大腦的細胞具有維持保護神經(jīng)元的作用，還具有抗氧化、傳遞神經(jīng)遞質、幫助學習記憶等功能〔8～10〕。缺血性腦疾病的發(fā)生與星形膠質細胞的損傷有關，缺血誘導星形膠質細胞氧化損傷和過度凋亡〔11〕。本實驗通過缺氧缺糖模擬生理性缺血過程，結果發(fā)現(xiàn)，缺氧缺糖后的星形膠質細胞LDH的漏出率升高，細胞凋亡增多，細胞增殖活性降低，說明成功構建了缺氧缺糖星形膠質細胞損傷模型。

天麻素常用于治療失眠、驚厥、半身不遂、癲癇等疾病，其可以通過血腦屏障到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而發(fā)揮促學習記憶、鎮(zhèn)靜等功效〔12～15〕。天麻素具有神經(jīng)保護功能，其可以降低Aβ1～42對海馬神經(jīng)元的損傷及缺氧誘導的神經(jīng)元損傷，天麻素對帕金森模型、阿爾茨海默病模型具有明顯的改善作用〔16,17〕。研究顯示，天麻素具有降低LPS誘導的星形膠質細胞炎性損傷的作用，并且可以降低LPS對星形膠質細胞凋亡誘導作用〔10,18,19〕。天麻素可以降低腦缺血再灌注星形膠質細胞釋放LDH水平，對腦缺血再灌注星形膠質細胞損傷具有保護作用〔20〕。本實驗結果顯示，天麻素預處理后的缺氧缺糖星形膠質細胞中LDH漏出率降低，細胞增殖活性升高，細胞凋亡水平降低，說明天麻素具有保護缺氧缺糖星形膠質細胞氧化損傷的作用。LDH原本存在于細胞內(nèi)，在細胞受到氧化應激等刺激以后，細胞膜結構受到破壞，導致細胞內(nèi)的LDH進入細胞外，因此檢測LDH漏出水平的高低可以間接反映細胞損傷程度〔21〕。正常情況下，細胞內(nèi)氧自由基處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當細胞內(nèi)氧自由基大量合成且不能被及時降解時，氧自由基可以刺激細胞內(nèi)的線粒體，導致線粒體膜電位下降，使原本存在于線粒體內(nèi)的CytC進入到細胞質內(nèi)，激活Caspase-9，誘導Caspase凋亡反應激活〔22～24〕。Bax是細胞凋亡促進蛋白，其表達水平的高低與細胞凋亡呈正相關〔25〕。本實驗結果表明，天麻素處理可以升高缺氧缺糖星形膠質細胞線粒體膜電位，減少胞質中CytC蛋白水平，降低細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平，提示天麻素可以通過線粒體途徑減少缺氧缺糖星形膠質細胞凋亡。

綜上，天麻素具有減輕缺氧缺糖星形膠質細胞損傷的作用，其可以通過降低氧化應激減少細胞凋亡發(fā)揮保護作用，對于其具體的作用機制還需要在以后進行探索。本實驗明確了天麻素對缺氧缺糖星形膠質細胞損傷的作用，為以后研究天麻素神經(jīng)保護作用提供了參考。