李開(kāi)言 張留記 屠萬(wàn)倩 劉曉苗

(1河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004；2河南中醫(yī)藥大學(xué))

骨關(guān)節(jié)炎(OA)以關(guān)節(jié)軟骨降解為特征，是危害人類健康的常見(jiàn)多發(fā)性疾病。懷牛膝是傳統(tǒng)道地藥材四大懷藥之一，具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎的臨床功效，是治療OA的常用中藥材。牛膝中含有活性成分多糖、甾酮、皂苷均可保護(hù)損傷的軟骨細(xì)胞，但作用機(jī)制不同。若將各活性成分按不同比例配伍作用于軟骨細(xì)胞，是否會(huì)產(chǎn)生增效作用需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)采用自制提取純化的牛膝多糖(ABP)和牛膝甾酮皂苷(ABTS)制備成含藥血清，按不同比例配伍后，考察對(duì)硝普鈉損傷C28/I2軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，探討ABP、ABTS聯(lián)合應(yīng)用是否能提高受損軟骨細(xì)胞的增殖活性，起到“減毒增效”作用，為防治OA的新藥開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 C28/I2細(xì)胞系：上海博全爾生物科技有限公司；懷牛膝藥材經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院都恒青研究員鑒定為莧科植物牛膝A.bidentata Bl.的干燥根；β-蛻皮甾酮(純度≥98%，批號(hào)111638-201402)和D-無(wú)水葡萄糖(批號(hào)833-201001)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參皂苷Ro(純度≥98%，批號(hào)1421)，購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。

雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司〔許可證號(hào)SCXK(魯)20140007，NO.37009200006686〕；硝普鈉(派尼化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20160508)；DMEM/F12培養(yǎng)基(博士德生物工程有限公司)；1×磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2～7.4，北京索萊寶科技有限公司)；澳洲新生胎牛血清(FBS500-S，AusGeneX)；胰蛋白酶-EDTA消化液(胰蛋白酶0.25%，EDTA 0.53 mmol/L，北京索萊寶科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1ABP及ABTS的制備 取牛膝藥材去蘆頭，搶水沖洗，60℃烘干后剪碎(黃豆大小)，按料液比1∶6加入70%乙醇，浸泡1 h，加熱回流提取2次，提取時(shí)間分別為1.5 h、1 h。收集提取液，濃縮至約1 000 ml，3 000 r/min離心30 min，殘?jiān)谜麴s水洗滌2次，每次20 ml，洗滌液與上清液合并。ABTS制備：上述濃縮液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂HP-20和SP-207，水洗，棄去水洗液；5%乙醇溶液洗脫，棄去5%乙醇溶液洗脫液；80%乙醇溶液洗脫，收集80%乙醇溶液洗脫液?；厥找掖紳饪s，即得ABTS；ABP制備：上述殘?jiān)鼡]干乙醇，加超純水3 000 ml，浸泡1 h，加熱回流提取2次，提取時(shí)間分別為2 h、1.5 h。收集提取液，濃縮至約1 000 ml，濃縮液緩緩加入乙醇，不斷攪拌，使含醇量至25%，靜止24 h，3 000 r/min離心30 min除去沉淀，上清液繼續(xù)緩慢加入一定量乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量至75%，靜止24 h，3 000 r/min離心30 min，收集沉淀物，干燥，即得ABP。

稱取一定量ABTS，甲醇溶解，β-蛻皮甾酮對(duì)照品為對(duì)照，UV242 nm測(cè)定總甾酮的含量；人參皂苷Ro對(duì)照品為對(duì)照，UV544 nm測(cè)定總皂苷的含量；稱

取一定量ABP，超純水溶解，葡萄糖對(duì)照品為對(duì)照，UV484 nm測(cè)定總多糖的含量。

1.2.2大鼠含藥血清的制備 分組：空白組、ABP組、ABTS組、ABP/ABTS生藥比(1∶1)混合物(ABP/ABTS)組，空白組30只，其余組各10只?？瞻捉M給予蒸餾水，給藥組均按 10.8 g/kg(生藥量)進(jìn)行大鼠灌胃7 d，末次給藥1 h后，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，56℃滅活，分裝后-80℃保存。

1.2.3細(xì)胞鋪板數(shù)的確定 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C28/I2細(xì)胞，分別按0.15×103、0.75×103、1.50×103、7.00×103、15.00×103、22.50×103、30.00×103個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl 0.5%噻唑藍(lán)(MTT)溶液培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清液，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫避光振蕩10 min，于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值。

1.2.4硝普鈉造模濃度的確定 C28/I2以最佳接種數(shù)于96孔板培養(yǎng)24 h，分別加入硝普鈉濃度0.00、0.50、0.60、0.75、0.90、1.00、1.10、1.25、1.50 mmol/L的含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后分別加入20 μl 0.5% MTT，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)(同1.2.2)，每組6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞存活率(%)=OD(硝普鈉各濃度組)/OD(硝普鈉0 mmol/L組)×100%。

1.2.5ABP、ABTS給藥時(shí)間的確定 C28/I2以最佳接種數(shù)于96孔板培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度ABP、ABTS、ABP/ABTS生藥比混合物與硝普鈉共培養(yǎng)24、48、72 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞OD值。實(shí)驗(yàn)分組見(jiàn)表1。

表1 含藥血清濃度梯度表(n=6)

1.2.6ABP/ABTS不同配比對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 C28/I2以最佳接種數(shù)于96孔板培養(yǎng)24 h，分別加入各濃度的ABP/ABTS配比與硝普鈉共培養(yǎng)24 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率(OD570)。實(shí)驗(yàn)分組見(jiàn)表2。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行單因素方差、LSD-t檢驗(yàn)分析。

表2 ABTS-ABP不同配比設(shè)置表(n=4)

2 結(jié) 果

2.1ABTS及ABP含量測(cè)定 如表3所示，ABP、總甾醇、總皂苷含量分別為(34.7±0.03)%、(16.8±0.03)%、(66.5±0.01)%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

表3 有效部位總成分含量測(cè)定結(jié)果

2.2細(xì)胞鋪板數(shù)的確定 細(xì)胞數(shù)(0.15×103)個(gè)/孔、(0.75×103)個(gè)/孔、(1.50×103)個(gè)/孔、(7.50×103)個(gè)/孔、(15.00×103)個(gè)/孔、(22.50×103)個(gè)/孔、(30.00×103)個(gè)/孔時(shí)OD值分別為(0.136±0.009)、(0.268±0.009)、(0.334±0.005)、(0.642±0.014)、(0.818±0.018)、(0.826±0.025)(0.840±0.024)。C28/I2細(xì)胞鋪板(0.75×103～15×103)個(gè)/孔時(shí)，與前一鋪板數(shù)比OD值增加明顯(P<0.05,n=6)，(15×103～30×103)個(gè)/孔OD值增加不明顯(P>0.05)，推測(cè)細(xì)胞數(shù)>(15×103)個(gè)/孔時(shí)，因空間不足，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。因此選用(15×103)個(gè)/孔作為最佳鋪板數(shù)。

2.3硝普鈉造模濃度的確定 如表4所示，硝普鈉濃度≤0.60 mmol/L時(shí)，OD值略有增加，說(shuō)明低濃度的硝普鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；當(dāng)硝普鈉濃度在0.75～1.50 mmol/L時(shí)，隨著硝普鈉濃度的增加OD值不斷減小，這說(shuō)明較高濃度的硝普鈉對(duì)細(xì)胞有損傷作用。為能使后期加藥保護(hù)得到一個(gè)理想的結(jié)果，因此選用存活率為50%左右1.00 mmol/L作為損傷模型的硝普鈉濃度。

表4 硝普鈉造模濃度確定表

2.4ABP、ABTS給藥時(shí)間的確定 與模型組相比，培養(yǎng)24 h除ABP/ABTS高濃度組外，其余組OD值均顯著升高(P<0.05)；培養(yǎng)48 h除ABP低濃度組、ABTS中濃度組、ABP/ABTS中、高濃度組外，其余組OD值均顯著升高(P<0.05)；培養(yǎng)72 h，ABP/ABTS低、中濃度組、ABP低濃度組及空白組OD值顯著高于模型組(P<0.05)?？紤]24 h較48、72 h各組OD值升高顯著，因此選取加入含藥血清培養(yǎng)24 h。見(jiàn)表5。

2.5ABP/ABTS不同配比對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 如表6所示，ABP為0.10%、0.50%、1.25%的3列數(shù)據(jù)以板1相關(guān)數(shù)據(jù)為參照(空白對(duì)照組0.849 7±0.004 9)，ABP為2.50%、5.00%的2列數(shù)據(jù)以板2相關(guān)數(shù)據(jù)為參照(空白對(duì)照組1.048 7±0.118 6)。

與ABP-ABTS(0.00%-0.00%)相比，所有ABP-ABTS配比OD值均升高，但只有板1：ABP 0.00%，ABTS 1.25%、50.00%時(shí)；ABP 0.10%、0.50%，ABTS所有濃度時(shí)；ABP 1.25%，ABTS除0.10%以外濃度時(shí)；板2：ABP 0.00%,ABTS 2.50%時(shí);ABP 5.00%,ABTS 0.50%、5.00%時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明含藥血清為0.10%時(shí)，已經(jīng)可以抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。板1中ABTS為5.00%、ABP為1.25%時(shí)OD值顯著高于空白對(duì)照(P<0.05)，推測(cè)ABP-ABTS最佳配比可能在1.25%-5.00%附近。

表5 ABP、ABST、ABP/ABST保護(hù)軟骨細(xì)胞的時(shí)效性

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

表6 ABTS-ABP不同配比OD值比較

與ABP-ABTS(0.00%-0.00%)比較：1)P<0.05,2)<0.01

3 討 論

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，OA的關(guān)節(jié)軟骨存在過(guò)度軟骨細(xì)胞凋亡，這可能是OA發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)〔1〕。軟骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡在軟骨的形成、新陳代謝及損傷修復(fù)整個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔2〕。牛膝為四大懷藥之一，是莧科植物牛膝Achyranthes bidentata B1.的干燥根，具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行之功效。在中醫(yī)藥文獻(xiàn)治療OA中，牛膝用藥頻次居第2位〔3〕。牛膝中含有甾酮類、皂苷類、多糖類等多種成分〔4〕，在治療OA中均發(fā)揮重要作用。甾酮屬于雌激素，能與骨雌激素受體結(jié)合，呈現(xiàn)出一定的抗骨質(zhì)疏松作用，人參皂苷可改善長(zhǎng)期大劑量激素使用后的激素抵抗，增加激素的抗炎作用，又不引起激素的副作用〔5〕。甘草多糖對(duì)離體大鼠軟骨細(xì)胞增殖和糖胺聚糖合成均有促進(jìn)作用〔6〕。牛膝提取物-蛻皮甾酮能夠保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞損傷，作用與目前公認(rèn)藥物硫酸軟骨素效果相當(dāng)〔7〕，可能與抑制一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)有關(guān)。邱蕓等〔8〕發(fā)現(xiàn)，ABP能夠促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎修復(fù)，具有很好的臨床價(jià)值。馬玉環(huán)等〔9〕發(fā)現(xiàn)，ABP促進(jìn)了軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達(dá)。孫雪蓮等〔10〕發(fā)現(xiàn)，牛膝總皂苷能顯著改善兔膝OA，抑制軟骨組織退變，與提高轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的表達(dá)有關(guān)。毛偉歡等〔11〕發(fā)現(xiàn)，牛膝醇溶液透入輔助治療OA患者療效佳，值得臨床推廣。楊麗萍等〔12〕發(fā)現(xiàn)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的中藥配伍對(duì)OA 的干預(yù)是多途徑多靶點(diǎn)的，涉及機(jī)體免疫、凋亡、細(xì)胞增殖、代謝等多個(gè)方面，是一個(gè)綜合調(diào)控的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，硝普鈉制造軟骨細(xì)胞損傷模型，用ABTS、ABP單獨(dú)作用于細(xì)胞，OD值明顯增大，細(xì)胞存活率升高，得出ABTS、ABP具有抗軟骨細(xì)胞凋亡的作用；ABTS、ABP兩兩配比，ABTS含量一定時(shí)，加入不同濃度ABP都會(huì)使OD值增大，且呈現(xiàn)一定的規(guī)律，提示ABTS配伍ABP能增效。實(shí)驗(yàn)初期設(shè)計(jì)的按生藥比例同時(shí)灌胃ABTS和ABP，制備混合含藥血清的方法，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，并沒(méi)有比兩個(gè)有效部位單獨(dú)使用更好，故有必要檢測(cè)ABTS-ABP不同配比對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響，從而獲得最佳增效組合。實(shí)驗(yàn)中ABTS-ABP配比為1.25%-5.00%時(shí)，存活率顯著增加，提示ABP-ABTS最佳配比1.25%-5.00%，但是這一配比經(jīng)過(guò)大鼠的體內(nèi)代謝，獲得的含藥血清中可能發(fā)生化學(xué)成分及含量改變，需要后期運(yùn)用薄層、液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)，對(duì)ABTS、ABP及ABTS/ABP顯著增效配比進(jìn)行含藥血清的定性定量分析，為研制治療OA新藥提供科學(xué)依據(jù)。