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        牛膝有效部位含藥血清聯(lián)用對(duì)損傷軟骨細(xì)胞的增效作用

        2019-05-10 04:59:28李開(kāi)言張留記屠萬(wàn)倩劉曉苗
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2019年9期
        關(guān)鍵詞:血清實(shí)驗(yàn)

        李開(kāi)言 張留記 屠萬(wàn)倩 劉曉苗

        (1河南省中醫(yī)藥研究院,河南 鄭州 450004;2河南中醫(yī)藥大學(xué))

        骨關(guān)節(jié)炎(OA)以關(guān)節(jié)軟骨降解為特征,是危害人類健康的常見(jiàn)多發(fā)性疾病。懷牛膝是傳統(tǒng)道地藥材四大懷藥之一,具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎的臨床功效,是治療OA的常用中藥材。牛膝中含有活性成分多糖、甾酮、皂苷均可保護(hù)損傷的軟骨細(xì)胞,但作用機(jī)制不同。若將各活性成分按不同比例配伍作用于軟骨細(xì)胞,是否會(huì)產(chǎn)生增效作用需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)采用自制提取純化的牛膝多糖(ABP)和牛膝甾酮皂苷(ABTS)制備成含藥血清,按不同比例配伍后,考察對(duì)硝普鈉損傷C28/I2軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用,探討ABP、ABTS聯(lián)合應(yīng)用是否能提高受損軟骨細(xì)胞的增殖活性,起到“減毒增效”作用,為防治OA的新藥開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1材料 C28/I2細(xì)胞系:上海博全爾生物科技有限公司;懷牛膝藥材經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院都恒青研究員鑒定為莧科植物牛膝A.bidentata Bl.的干燥根;β-蛻皮甾酮(純度≥98%,批號(hào)111638-201402)和D-無(wú)水葡萄糖(批號(hào)833-201001),購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;人參皂苷Ro(純度≥98%,批號(hào)1421),購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。

        雄性SPF級(jí)SD大鼠60只,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司〔許可證號(hào)SCXK(魯)20140007,NO.37009200006686〕;硝普鈉(派尼化學(xué)試劑廠,批號(hào):20160508);DMEM/F12培養(yǎng)基(博士德生物工程有限公司);1×磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2~7.4,北京索萊寶科技有限公司);澳洲新生胎牛血清(FBS500-S,AusGeneX);胰蛋白酶-EDTA消化液(胰蛋白酶0.25%,EDTA 0.53 mmol/L,北京索萊寶科技有限公司)。

        1.2方法

        1.2.1ABP及ABTS的制備 取牛膝藥材去蘆頭,搶水沖洗,60℃烘干后剪碎(黃豆大小),按料液比1∶6加入70%乙醇,浸泡1 h,加熱回流提取2次,提取時(shí)間分別為1.5 h、1 h。收集提取液,濃縮至約1 000 ml,3 000 r/min離心30 min,殘?jiān)谜麴s水洗滌2次,每次20 ml,洗滌液與上清液合并。ABTS制備:上述濃縮液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂HP-20和SP-207,水洗,棄去水洗液;5%乙醇溶液洗脫,棄去5%乙醇溶液洗脫液;80%乙醇溶液洗脫,收集80%乙醇溶液洗脫液?;厥找掖紳饪s,即得ABTS;ABP制備:上述殘?jiān)鼡]干乙醇,加超純水3 000 ml,浸泡1 h,加熱回流提取2次,提取時(shí)間分別為2 h、1.5 h。收集提取液,濃縮至約1 000 ml,濃縮液緩緩加入乙醇,不斷攪拌,使含醇量至25%,靜止24 h,3 000 r/min離心30 min除去沉淀,上清液繼續(xù)緩慢加入一定量乙醇,邊加邊攪拌,使含醇量至75%,靜止24 h,3 000 r/min離心30 min,收集沉淀物,干燥,即得ABP。

        稱取一定量ABTS,甲醇溶解,β-蛻皮甾酮對(duì)照品為對(duì)照,UV242 nm測(cè)定總甾酮的含量;人參皂苷Ro對(duì)照品為對(duì)照,UV544 nm測(cè)定總皂苷的含量;稱

        取一定量ABP,超純水溶解,葡萄糖對(duì)照品為對(duì)照,UV484 nm測(cè)定總多糖的含量。

        1.2.2大鼠含藥血清的制備 分組:空白組、ABP組、ABTS組、ABP/ABTS生藥比(1∶1)混合物(ABP/ABTS)組,空白組30只,其余組各10只??瞻捉M給予蒸餾水,給藥組均按 10.8 g/kg(生藥量)進(jìn)行大鼠灌胃7 d,末次給藥1 h后,腹主動(dòng)脈取血,分離血清,56℃滅活,分裝后-80℃保存。

        1.2.3細(xì)胞鋪板數(shù)的確定 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C28/I2細(xì)胞,分別按0.15×103、0.75×103、1.50×103、7.00×103、15.00×103、22.50×103、30.00×103個(gè)/孔接種于96孔板,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h,每孔加入20 μl 0.5%噻唑藍(lán)(MTT)溶液培養(yǎng)4 h,小心吸棄上清液,加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),室溫避光振蕩10 min,于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值。

        1.2.4硝普鈉造模濃度的確定 C28/I2以最佳接種數(shù)于96孔板培養(yǎng)24 h,分別加入硝普鈉濃度0.00、0.50、0.60、0.75、0.90、1.00、1.10、1.25、1.50 mmol/L的含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后分別加入20 μl 0.5% MTT,進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)(同1.2.2),每組6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞存活率(%)=OD(硝普鈉各濃度組)/OD(硝普鈉0 mmol/L組)×100%。

        1.2.5ABP、ABTS給藥時(shí)間的確定 C28/I2以最佳接種數(shù)于96孔板培養(yǎng)24 h,分別加入不同濃度ABP、ABTS、ABP/ABTS生藥比混合物與硝普鈉共培養(yǎng)24、48、72 h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞OD值。實(shí)驗(yàn)分組見(jiàn)表1。

        表1 含藥血清濃度梯度表(n=6)

        1.2.6ABP/ABTS不同配比對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 C28/I2以最佳接種數(shù)于96孔板培養(yǎng)24 h,分別加入各濃度的ABP/ABTS配比與硝普鈉共培養(yǎng)24 h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率(OD570)。實(shí)驗(yàn)分組見(jiàn)表2。

        1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行單因素方差、LSD-t檢驗(yàn)分析。

        表2 ABTS-ABP不同配比設(shè)置表(n=4)

        2 結(jié) 果

        2.1ABTS及ABP含量測(cè)定 如表3所示,ABP、總甾醇、總皂苷含量分別為(34.7±0.03)%、(16.8±0.03)%、(66.5±0.01)%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

        表3 有效部位總成分含量測(cè)定結(jié)果

        2.2細(xì)胞鋪板數(shù)的確定 細(xì)胞數(shù)(0.15×103)個(gè)/孔、(0.75×103)個(gè)/孔、(1.50×103)個(gè)/孔、(7.50×103)個(gè)/孔、(15.00×103)個(gè)/孔、(22.50×103)個(gè)/孔、(30.00×103)個(gè)/孔時(shí)OD值分別為(0.136±0.009)、(0.268±0.009)、(0.334±0.005)、(0.642±0.014)、(0.818±0.018)、(0.826±0.025)(0.840±0.024)。C28/I2細(xì)胞鋪板(0.75×103~15×103)個(gè)/孔時(shí),與前一鋪板數(shù)比OD值增加明顯(P<0.05,n=6),(15×103~30×103)個(gè)/孔OD值增加不明顯(P>0.05),推測(cè)細(xì)胞數(shù)>(15×103)個(gè)/孔時(shí),因空間不足,細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。因此選用(15×103)個(gè)/孔作為最佳鋪板數(shù)。

        2.3硝普鈉造模濃度的確定 如表4所示,硝普鈉濃度≤0.60 mmol/L時(shí),OD值略有增加,說(shuō)明低濃度的硝普鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用;當(dāng)硝普鈉濃度在0.75~1.50 mmol/L時(shí),隨著硝普鈉濃度的增加OD值不斷減小,這說(shuō)明較高濃度的硝普鈉對(duì)細(xì)胞有損傷作用。為能使后期加藥保護(hù)得到一個(gè)理想的結(jié)果,因此選用存活率為50%左右1.00 mmol/L作為損傷模型的硝普鈉濃度。

        表4 硝普鈉造模濃度確定表

        2.4ABP、ABTS給藥時(shí)間的確定 與模型組相比,培養(yǎng)24 h除ABP/ABTS高濃度組外,其余組OD值均顯著升高(P<0.05);培養(yǎng)48 h除ABP低濃度組、ABTS中濃度組、ABP/ABTS中、高濃度組外,其余組OD值均顯著升高(P<0.05);培養(yǎng)72 h,ABP/ABTS低、中濃度組、ABP低濃度組及空白組OD值顯著高于模型組(P<0.05)??紤]24 h較48、72 h各組OD值升高顯著,因此選取加入含藥血清培養(yǎng)24 h。見(jiàn)表5。

        2.5ABP/ABTS不同配比對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 如表6所示,ABP為0.10%、0.50%、1.25%的3列數(shù)據(jù)以板1相關(guān)數(shù)據(jù)為參照(空白對(duì)照組0.849 7±0.004 9),ABP為2.50%、5.00%的2列數(shù)據(jù)以板2相關(guān)數(shù)據(jù)為參照(空白對(duì)照組1.048 7±0.118 6)。

        與ABP-ABTS(0.00%-0.00%)相比,所有ABP-ABTS配比OD值均升高,但只有板1:ABP 0.00%,ABTS 1.25%、50.00%時(shí);ABP 0.10%、0.50%,ABTS所有濃度時(shí);ABP 1.25%,ABTS除0.10%以外濃度時(shí);板2:ABP 0.00%,ABTS 2.50%時(shí);ABP 5.00%,ABTS 0.50%、5.00%時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明含藥血清為0.10%時(shí),已經(jīng)可以抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。板1中ABTS為5.00%、ABP為1.25%時(shí)OD值顯著高于空白對(duì)照(P<0.05),推測(cè)ABP-ABTS最佳配比可能在1.25%-5.00%附近。

        表5 ABP、ABST、ABP/ABST保護(hù)軟骨細(xì)胞的時(shí)效性

        與模型組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

        表6 ABTS-ABP不同配比OD值比較

        與ABP-ABTS(0.00%-0.00%)比較:1)P<0.05,2)<0.01

        3 討 論

        實(shí)驗(yàn)證實(shí),OA的關(guān)節(jié)軟骨存在過(guò)度軟骨細(xì)胞凋亡,這可能是OA發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)〔1〕。軟骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡在軟骨的形成、新陳代謝及損傷修復(fù)整個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔2〕。牛膝為四大懷藥之一,是莧科植物牛膝Achyranthes bidentata B1.的干燥根,具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行之功效。在中醫(yī)藥文獻(xiàn)治療OA中,牛膝用藥頻次居第2位〔3〕。牛膝中含有甾酮類、皂苷類、多糖類等多種成分〔4〕,在治療OA中均發(fā)揮重要作用。甾酮屬于雌激素,能與骨雌激素受體結(jié)合,呈現(xiàn)出一定的抗骨質(zhì)疏松作用,人參皂苷可改善長(zhǎng)期大劑量激素使用后的激素抵抗,增加激素的抗炎作用,又不引起激素的副作用〔5〕。甘草多糖對(duì)離體大鼠軟骨細(xì)胞增殖和糖胺聚糖合成均有促進(jìn)作用〔6〕。牛膝提取物-蛻皮甾酮能夠保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞損傷,作用與目前公認(rèn)藥物硫酸軟骨素效果相當(dāng)〔7〕,可能與抑制一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)有關(guān)。邱蕓等〔8〕發(fā)現(xiàn),ABP能夠促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎修復(fù),具有很好的臨床價(jià)值。馬玉環(huán)等〔9〕發(fā)現(xiàn),ABP促進(jìn)了軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達(dá)。孫雪蓮等〔10〕發(fā)現(xiàn),牛膝總皂苷能顯著改善兔膝OA,抑制軟骨組織退變,與提高轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的表達(dá)有關(guān)。毛偉歡等〔11〕發(fā)現(xiàn),牛膝醇溶液透入輔助治療OA患者療效佳,值得臨床推廣。楊麗萍等〔12〕發(fā)現(xiàn)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的中藥配伍對(duì)OA 的干預(yù)是多途徑多靶點(diǎn)的,涉及機(jī)體免疫、凋亡、細(xì)胞增殖、代謝等多個(gè)方面,是一個(gè)綜合調(diào)控的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法,硝普鈉制造軟骨細(xì)胞損傷模型,用ABTS、ABP單獨(dú)作用于細(xì)胞,OD值明顯增大,細(xì)胞存活率升高,得出ABTS、ABP具有抗軟骨細(xì)胞凋亡的作用;ABTS、ABP兩兩配比,ABTS含量一定時(shí),加入不同濃度ABP都會(huì)使OD值增大,且呈現(xiàn)一定的規(guī)律,提示ABTS配伍ABP能增效。實(shí)驗(yàn)初期設(shè)計(jì)的按生藥比例同時(shí)灌胃ABTS和ABP,制備混合含藥血清的方法,從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看,并沒(méi)有比兩個(gè)有效部位單獨(dú)使用更好,故有必要檢測(cè)ABTS-ABP不同配比對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響,從而獲得最佳增效組合。實(shí)驗(yàn)中ABTS-ABP配比為1.25%-5.00%時(shí),存活率顯著增加,提示ABP-ABTS最佳配比1.25%-5.00%,但是這一配比經(jīng)過(guò)大鼠的體內(nèi)代謝,獲得的含藥血清中可能發(fā)生化學(xué)成分及含量改變,需要后期運(yùn)用薄層、液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù),對(duì)ABTS、ABP及ABTS/ABP顯著增效配比進(jìn)行含藥血清的定性定量分析,為研制治療OA新藥提供科學(xué)依據(jù)。

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