邵帥 洪樂鵬 鄧雪華 江梅 丁濤 姜經(jīng)航 王開秀

(1荊門市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，湖北 荊門 448000；2廣州醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室;3韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室)

研究顯示，帕金森病(PD)模型中有磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKt)信號(hào)通路的抑制〔1～7〕，說明該通路參與PD發(fā)病的相關(guān)進(jìn)程，而PD的神經(jīng)保護(hù)類藥物也是通過PI3K/AKt信號(hào)通路來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的，如：在6-羥基多巴誘導(dǎo)的PD模型中，人堿性成纖維細(xì)胞生長因子通過PI3K/AKt信號(hào)通路來抑制Tau蛋白磷酸化〔8〕；來自金銀花的提取物類黃酮也可以通過PI3K/AKt信號(hào)通路來抑制小鼠小膠質(zhì)瘤細(xì)胞(BV2)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)〔9〕。盡管PI3K/AKt信號(hào)通路在PD的發(fā)病及神經(jīng)保護(hù)作用中扮演重要角色，但目前尚無研究報(bào)道關(guān)于抑制PI3K/AKt信號(hào)通路對(duì)PD炎癥反應(yīng)的影響。本文觀察抑制PI3K/AKt信號(hào)通路對(duì)PD炎癥反應(yīng)表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 BV2細(xì)胞株為南方醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室惠贈(zèng)。DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國GIBCO公司；脂多糖(LPS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體購自美國Sigma公司；LY294002(LY)購自美國Santa Cruz公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)液購自賽默飛公司；磷酸化(p)-AKt、AKt抗體購自Abcam公司；β-actin、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記-山羊抗兔為中杉金橋生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品；Trizol 購自美國invitrogen 公司。RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、RNase-free H2O均購自TakaRa公司。

1.2方法

1.2.1BV2細(xì)胞培養(yǎng) BV2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基+10%FBS+1%青鏈霉素，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h換液。

1.2.2細(xì)胞處理及分組 BV2細(xì)胞消化傳代以1×105/ml接種于6孔板中并加入2 ml完全培養(yǎng)基，24 h后換液并處理細(xì)胞，細(xì)胞共分為4組：(1)對(duì)照組：相同的時(shí)間加入等量的生理鹽水；(2)LPS組：1 μg/ml LPS孵育24 h；(3)LY+LPS組：20 μmol/L LY處理0.5 h后，1 μg/ml LPS孵育24 h；(4)LY組：20 μmol/L LY處理。

1.2.3Western印跡檢測 細(xì)胞經(jīng)上述藥物處理后，加入RIPA 裂解液〔含1%的苯甲基磺酰氟(PMSF)〕提取蛋白，酶標(biāo)儀檢測蛋白濃度。總蛋白與上樣緩沖液進(jìn)行加熱變性，用40 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)/聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，然后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉，一抗p-AKt、AKt、iNOS、β-actin各1∶1 000稀釋孵育，4℃過夜，二抗1∶1 000 室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

1.2.4.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Primer-BLAST 的cDNA 序列，分別設(shè)計(jì)β-actin、白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α引物序號(hào)。β-actin正義鏈5′-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3′，反義鏈5′-CAGAAGCAATGCTGTCACCTT-3′；IL-1β正義鏈5′-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′，反義鏈5′-GGAAGGTCCACGGGAAAGAC-3′；TNF-α正義鏈5′-ATGGCCTCCCTCTCATCAGT-3′，反義鏈5′-ATAGCAAATCGGCTGACGGT-3′。

1.2.4.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA。在NanoDrop-1000分光光度計(jì)上檢測RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的降解度，將各組的RNA通過RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，添加上表中相關(guān)引物擴(kuò)增各基因。ABI 7500軟件檢測各基因的mRNA表達(dá)水平。熒光定量PCR擴(kuò)增條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每組均重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1LPS處理后對(duì)PI3K/AKt信號(hào)通路的影響 LPS組p-AKt/AKt蛋白比明顯下調(diào)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；LY+LPS組p-AKt/AKt蛋白比顯著低于LPS組(P<0.01)。LY組p-AKt/AKt蛋白比顯著高于LY+LPS組(P<0.01)。各組AKt蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

2.2抑制PI3K/AKt信號(hào)通路對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響 LPS組IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(均P<0.01)；LY+LPS組IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)顯著低于LPS組(均P<0.01)；LY組IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯低于LY+LPS組(均P<0.01)。見表1。

圖1 Western印跡檢測各組p-AKt、AKt蛋白表達(dá)

2.3抑制PI3K/AKt信號(hào)通路對(duì)iNOS表達(dá)的影響 LPS組iNOS蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；LY+LPS組iNOS蛋白表達(dá)顯著低于LPS組(P<0.01)。LY組iNOS蛋白表達(dá)顯著低于LY+LPS組(P<0.01)。見圖2，表1。

圖2 Western印跡檢測各組iNOS蛋白表達(dá)

表1 各組p-AKt/AKt、AKt、iNOS蛋白及IL-1β 、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與LPS組比較：2)P<0.01；與LY+LPS組比較：3)P<0.01

3 討 論

PD是除了阿爾茨海默病外的第二大神經(jīng)退行性疾病，多見于中老年人，但近年隨著環(huán)境惡化，PD也逐漸年輕化。調(diào)查顯示65歲以上PD患病率為1%，85歲以上PD患病率為5%〔10〕。目前尚無有效治療PD的方法，針對(duì)PD癥狀治療的藥物也無法干預(yù)PD的進(jìn)程，因此從PD的發(fā)病機(jī)制尋找治療方法勢在必行，小膠質(zhì)細(xì)胞參與的神經(jīng)炎癥導(dǎo)致的多巴胺能神經(jīng)元死亡在PD發(fā)病及其進(jìn)程中發(fā)揮重要作用〔11〕。

PI3K/AKt信號(hào)通路除調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝、抗細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)作用外，還能調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶能力。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKt信號(hào)通路與PD的聯(lián)系越來越緊密，PI3K/AKt信號(hào)在PD中存在通路抑制，而且神經(jīng)保護(hù)藥物也是通過該通路發(fā)揮作用，如：E3泛素連接酶c-Cb1抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與PI3K/AKt信號(hào)通路有關(guān)〔12〕，法舒地爾在PD模型內(nèi)也是通過PI3K/AKt信號(hào)通路依賴的方式來抑制炎癥，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔13〕?？梢圆孪雴为?dú)激活PI3K/AKt信號(hào)通路也可以發(fā)揮一定抑炎及神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究中LPS刺激BV2細(xì)胞后產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)PI3K/AKt信號(hào)通路的抑制，這與Dilshara等〔14〕的研究結(jié)果相一致。LY預(yù)處理抑制PI3K/AKt信號(hào)通路后則明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平；單獨(dú)使用LY預(yù)處理抑制PI3K/AKt信號(hào)后則出現(xiàn)更為明顯的炎癥抑制效果；iNOS既作為促炎因子又作為氧化應(yīng)激分子，在PD發(fā)病機(jī)制及加速神經(jīng)死亡中發(fā)揮重要作用，LY預(yù)處理抑制PI3K/AKt信號(hào)通路后，不管是炎性反應(yīng)激活中的iNOS蛋白，還是正常細(xì)胞中的iNOS蛋白表達(dá)均被明顯抑制。單從文獻(xiàn)報(bào)道的神經(jīng)保護(hù)類藥物可以通過PI3K/AKt信號(hào)通路來發(fā)揮對(duì)PD的神經(jīng)保護(hù)作用來看，激活PI3K/AKt信號(hào)通路后應(yīng)該會(huì)對(duì)PD起一定的有利作用，而本研究結(jié)果剛好與預(yù)想結(jié)果相矛盾，炎癥反應(yīng)中PI3K/AKt信號(hào)通路與PD的作用需進(jìn)一步深入研究，也有可能與細(xì)胞的不同，藥物預(yù)處理時(shí)間不同等有關(guān)。

綜上所述，炎癥反應(yīng)中有PI3K/AKt信號(hào)通路的抑制，LY抑制PI3K/AKt信號(hào)通路后，可以明顯抑制促炎因子的表達(dá)，具體的抑炎有待進(jìn)一步研究查證，這為從炎性反應(yīng)方向和PI3K/AKt信號(hào)通路研究PD提供了新的思考，為PD的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。