聶連桂 劉茂軍 陳堅(jiān) 吳倩 譚文婷 劉盛權(quán) 褚春 唐芬 龍俊蓉 楊軍

(南華大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421000;2附屬第二醫(yī)院藥劑科)

阿霉素作為一種高效的蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，隨著上市后在臨床的廣泛應(yīng)用已被證明對(duì)人體具有不可逆的時(shí)間和劑量依賴性心臟毒性，可導(dǎo)致類似于擴(kuò)張型心肌病的病變。而心肌纖維化不僅是擴(kuò)張型心肌病主要的病理變化之一，也是阿霉素誘導(dǎo)擴(kuò)張型心肌病的病理生理過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔1，2〕。但目前對(duì)于阿霉素誘導(dǎo)心肌纖維化發(fā)生的具體機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)1/ErbB2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與保護(hù)心肌、改善心肌纖維化等過程關(guān)系密切〔3，4〕，心肌細(xì)胞中NRG1可通過激活被稱為ErbBs蛋白的受體酪氨酸激酶〔表皮生長因子(EGF)受體的經(jīng)典成員〕進(jìn)行一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而參與心肌纖維化過程〔5〕。硫化氫(H2S)作為一種新型的氣體信號(hào)分子，其在心血管系統(tǒng)中參與一系列的生物保護(hù)效應(yīng)，已有研究表明H2S在動(dòng)物模型中具有保護(hù)心肌，改善心肌纖維化的作用〔6，7〕。但目前對(duì)于H2S是否具有改善阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化的作用及其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制均尚不明確。本研究觀察H2S對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化及NRG1、ErbB2蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性成年SD大鼠40只，體重取180～200 g，購于長沙斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；飼養(yǎng)于溫度適宜(22±2)℃的恒定環(huán)境中，晝夜各12 h，大鼠均可自由進(jìn)食，飲水；分籠飼養(yǎng)，定期消毒。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 阿霉素購于美侖生物公司；NRG1和ErbB2一抗、抗兔二抗購于中國武漢博士德生物有限公司；GAPDH一抗(兔源)購于中國晶欣生物公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和細(xì)胞裂解液購于中國碧云天生物公司；硫氫化鈉(NaHS,H2S供體)購于美國Sigma公司；Masson染色試劑盒購于中國邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3動(dòng)物模型的建立 將40只SD大鼠置于恒溫環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、H2S模型組、H2S對(duì)照組，每組各10只。模型組和H2S模型組采用2 w分6次腹腔注射阿霉素，劑量為3 mg/(kg·次)(注射前用生理鹽水稀釋至0.5 mg/ml，造模2 w總劑量為18 mg/kg)造模，對(duì)照組及H2S對(duì)照組予以同等劑量的生理鹽水腹腔注射共6次。2 w后，H2S模型組及H2S對(duì)照組給予NaHS〔56 μmol/(kg·d)，溶于1 ml生理鹽水中，使用前新鮮配制〕腹腔注射，對(duì)照組和模型組使用同等劑量的生理鹽水腹腔注射。建模8 w后，將所有大鼠麻醉后處死。

1.4Masson染色觀察心肌纖維化沉積 取各組左室心肌組織，置于10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制成切片〔(3±1)mm〕，嚴(yán)格按照說明書步驟開始Masson染色；隨后在40×10倍鏡下選取不同視野，每個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)視野，觀察染色區(qū)域的膠原纖維染色面積，比較各組膠原沉積情況。

1.5Western印跡檢測心肌組織中NRG1和ErbB2蛋白的表達(dá) 取各組左室心肌組織，提取蛋白后經(jīng)BCA比色法定量；取蛋白樣本經(jīng)99℃煮10 min；嚴(yán)格按照說明書比例配置10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠置于電泳緩沖液中電泳；取目的條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；Tween-20 Tris-鹽酸緩沖液(TBST)封閉；經(jīng)NRG1和ErbB2及GAPDH一抗(稀釋度為1∶1 000)37℃孵育后置4℃過夜；經(jīng)TBST洗膜后用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔二抗(稀釋度為1∶2 000)37℃孵育后；再經(jīng)TBST洗膜；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影；曝光，掃描；經(jīng)Image J軟件對(duì)靶蛋白條帶進(jìn)行光密度分析。取GAPDH一抗為內(nèi)參，將目的條帶與內(nèi)參灰度比值分別表示NRG1和ErbB2蛋白表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠存活情況 8 w后，共存活33只SD雄性大鼠，其中對(duì)照組10只、模型組6只、H2S模型組7只、H2S對(duì)照組10只。

2.2各組心肌纖維化沉積 鏡下觀察膠原纖維染呈藍(lán)色。模型組心肌纖維沉積較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)；H2S模型組心肌組織纖維沉積較模型組顯著減少(P<0.05)。H2S對(duì)照組與對(duì)照組相比無明顯差異。見圖1。

圖1 各組心肌纖維化沉積(Masson染色，40×10)

2.3各組心肌組織NRG1蛋白表達(dá) 與對(duì)照組(0.95±0.019)比較，模型組心肌組織NRG1蛋白表達(dá)(0.72±0.116)顯著降低(P<0.05)；H2S模型組心肌組織NRG1蛋白表達(dá)(1.02±0.045)較模型組顯著升高(P<0.05)；對(duì)照組與H2S對(duì)照組NRG1的表達(dá)(1.03±0.047)無明顯差別(P>0.05)。見圖2。

2.4各組心肌組織ErbB2蛋白表達(dá) 與對(duì)照組(0.91±0.019)比較，模型組心肌組織ErbB2蛋白表達(dá)(0.61±0.115)顯著降低(P<0.01)；H2S模型組心肌組織ErbB2蛋白表達(dá)(0.89±0.015)較模型組顯著升高(P<0.01)；對(duì)照組與H2S對(duì)照組ErbB2表達(dá)(0.80±0.054)無明顯差別(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組NRG1和ErbB2蛋白表達(dá)水平

3 討 論

阿霉素作為一種高效的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，通過與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ結(jié)合，可破壞DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)，抑制RNA和DNA的合成，從而發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。然而，阿霉素抗腫瘤治療的同時(shí)在一定程度上也對(duì)正常細(xì)胞，尤其是心肌細(xì)胞具有極強(qiáng)的殺傷作用〔8〕。有實(shí)驗(yàn)證明阿霉素可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡〔1〕，而心肌細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞增生并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加，從而發(fā)生心肌纖維化〔9〕。本研究與文獻(xiàn)〔9〕報(bào)道類似，說明采用腹腔注射阿霉素可導(dǎo)致大鼠明顯的心肌纖維化。研究顯示氧化應(yīng)激、自身免疫等可能參與阿霉素導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制，但具體的調(diào)控機(jī)制目前尚不十分明確〔10〕。NRG1/ErbB系統(tǒng)是一種調(diào)節(jié)心臟功能和適應(yīng)的內(nèi)皮控制的旁分泌系統(tǒng)。NRG1是一類含有EGF樣結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)營養(yǎng)和腫瘤抑制因子，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心肌細(xì)胞中。NRG1的EGF樣結(jié)構(gòu)域與受體ErbB蛋白結(jié)合并激活受體的酪氨酸激酶活性，從而觸發(fā)下游信號(hào)通路，激活一系列細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。NRG1受體包括 ErbB2、ErbB3及ErbB4〔3〕，成熟心肌細(xì)胞中表達(dá)ErbB4和ErbB2，NRG1與ErbB4高親和力捆綁，在心肌細(xì)胞中NRG1優(yōu)先與ErbB2發(fā)生二聚反應(yīng)，進(jìn)而通過跨膜螺旋結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)的激酶域活化發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔8〕。NRG1從心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放，通過在心肌細(xì)胞中表達(dá)的ErbBs作為旁分泌因子調(diào)節(jié)心臟發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)。研究顯示NRG1/ErbB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與心肌纖維化發(fā)生機(jī)制〔11，12〕，也有研究表明，心臟中高表達(dá)NRG1可以保護(hù)心肌細(xì)胞，而阿霉素能明顯減少 NRG和ErbB表達(dá)〔13〕。本研究提示NRG1/ErbB2信號(hào)通路可能參與阿霉素導(dǎo)致的心肌纖維化調(diào)控機(jī)制。

H2S分子作為一種具有廣泛生理功能的氣體信號(hào)分子，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，已有文獻(xiàn)闡述了H2S可通過保護(hù)線粒體功能、降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎性反應(yīng)等機(jī)制減少心肌細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用〔14〕。而H2S對(duì)心肌纖維化的改善作用已在糖尿病心肌病、甲狀腺功能亢進(jìn)性心肌病等多個(gè)模型中被證明〔6，15〕。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)NRG1/ErbB2信號(hào)通路參與多種病理生理過程，與慢性心力衰竭、急性心肌梗死等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3，4〕。在糖尿病心肌病等以心肌纖維化為病理改變?yōu)榛A(chǔ)的心肌病模型中已證明，NRG1/ErbB信號(hào)系統(tǒng)在維持心功能及逆轉(zhuǎn)心肌重塑中發(fā)揮關(guān)鍵性作用〔16〕。本研究提示H2S改善阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化的機(jī)制可能與上調(diào)NRG1和ErbB2的表達(dá)有關(guān)。提示H2S可能通過上調(diào)NRG1/ErbB2通路抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌纖維化，但其具體信號(hào)調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。