王福安

(平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 平頂山 467000)

由于胃癌惡性程度高、死亡率高及易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特征，對(duì)患者產(chǎn)生的影響十分嚴(yán)重，并且由于早期癥狀不明顯，大部分患者在發(fā)現(xiàn)后病情已處于嚴(yán)重階段，胃癌的早期診斷與臨床治療急需發(fā)展與創(chuàng)新〔1，2〕。相關(guān)研究實(shí)現(xiàn)，胃癌的發(fā)病率會(huì)隨著患者年齡的增長(zhǎng)而升高，老年人群的患病率極高，且老年胃癌具有組織分化程度高、腫瘤惡性程度低及生物學(xué)侵襲性弱等特征〔3〕。對(duì)老年胃癌患者的生物學(xué)行為差異等進(jìn)行分析，有助于老年胃癌的診斷及個(gè)性化治療。本研究擬分析miR-596高表達(dá)水平與低表達(dá)水平患者的臨床特征，利用CCK-8實(shí)驗(yàn)與Transwell穿孔實(shí)驗(yàn)分析AGS細(xì)胞的增殖與侵襲能力，分析miR-596在老年胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取90例老年胃癌患者作為研究對(duì)象，分別采集患者的胃癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本進(jìn)行研究，男40例，女50例，年齡65～85〔平均(72.31±4.85)〕歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①簽署院內(nèi)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的研究實(shí)驗(yàn)知情同意書；②經(jīng)胃鏡病理檢查確診為胃部惡性腫瘤；③CT檢查等明確TNM分期為Ⅰ～Ⅳ期；④年齡在65周歲以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前進(jìn)行放療、化療或是中西醫(yī)結(jié)合抗腫瘤治療患者；②病情嚴(yán)重?zé)o法簽署知情同意書患者；③合并其他嚴(yán)重器官疾病患者。

1.2儀器與試劑 普通冰箱、超低溫冰箱、PCR儀、顯微鏡、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、消毒器、微波爐以及電子分析天平等。美國(guó)Gibco公司的RPMI1640培養(yǎng)基與胎牛血清(FBS)、總RNA提取試劑盒Trizol、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR RT-PCR檢測(cè)試劑盒、miRNA檢測(cè)試劑盒、miR-596mimics與陰性對(duì)照、CCK-8檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Transwell平板。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 在胃癌組織樣本離體30 min之內(nèi)，提取部分胃癌組織，并去除組織標(biāo)本中的脂肪組織，使用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基將胃粘膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞放到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃和5%CO2，在細(xì)胞生長(zhǎng)到90%匯合度后實(shí)施傳代。

使用胰蛋白酶對(duì)研磨后的組織進(jìn)行離心處理，去除上清，隨后加入總RNA提取試劑Trizol及氯仿，將組織樣本進(jìn)行4℃高速離心處理，提取處理后的上層澄清液體，再加入等量的異丙醇，再進(jìn)行離心處理，去除上清，隨后使用75%的乙醇溶液進(jìn)行洗滌，洗滌晾干后再加入水溶液，并測(cè)量濃度。隨后依照使用說(shuō)明書，將制取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用SYBR RT-PCR檢測(cè)試劑盒，將U6作為內(nèi)參，檢測(cè)不同樣本中的miR-596含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，且每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)比胃癌組織及癌旁組織的miR-596表達(dá)水平。

提取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的胃癌細(xì)胞，并將細(xì)胞鋪入孔板中培養(yǎng)24 h，隨后實(shí)施miRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過(guò)程中把轉(zhuǎn)染試劑與miR-596mimics與陰性對(duì)照進(jìn)行混合，待靜止后將其加入到對(duì)應(yīng)的孔中，轉(zhuǎn)染6 h后換液，并于48 h后進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)檢測(cè)。

在miRNA轉(zhuǎn)染完成48 h后，利用CCK-8檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，嚴(yán)格依照試劑盒的說(shuō)明書實(shí)施檢測(cè)，通過(guò)酶標(biāo)儀于490 mm波長(zhǎng)處，進(jìn)行吸光度值測(cè)量，再減去空白孔值，得出檢測(cè)標(biāo)本的細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果。

Transwell穿孔實(shí)驗(yàn)：在miRNA轉(zhuǎn)染完成48 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化后使用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基對(duì)樣本進(jìn)行重懸，并將相同數(shù)量的細(xì)胞放置于Transwell上層小室當(dāng)中，下層放入含10%FBS的培養(yǎng)基，將其放置于培養(yǎng)箱中24 h，隨后觀察統(tǒng)計(jì)小室外層細(xì)胞核染色數(shù)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織和癌旁正常組織中的miR-596表達(dá)水平對(duì)比 胃癌組織中miR-596平均表達(dá)水平為(1.31±0.14)，癌旁正常組織中miR-596平均表達(dá)水平為(2.21±0.44)，miR-596在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織中的表達(dá)(P<0.05)。

2.2miR-596高表達(dá)水平與低表達(dá)水平患者的臨床特征對(duì)比 90例患者中miR-596高表達(dá)水平患者42例，低表達(dá)水平患者48例，兩組患者的性別、腫瘤細(xì)胞分化程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的高表達(dá)發(fā)生率顯著低于未轉(zhuǎn)移患者，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者中的高表達(dá)發(fā)生率顯著高于Ⅲ～Ⅳ期患者，腫瘤直徑<3 cm患者中高表達(dá)發(fā)生率顯著高于≥3 cm患者，老年胃癌患者的miR-596表達(dá)水平和患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期及腫瘤直徑具有顯著的相關(guān)性(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 miR-596高表達(dá)水平與低表達(dá)水平患者的臨床特征對(duì)比分析〔n(%)〕

2.3過(guò)表達(dá)miR-596抑制癌細(xì)胞增殖與侵襲能力分析 轉(zhuǎn)染miR-596胃癌細(xì)胞的增殖作用顯著低于正常胃癌細(xì)胞(0.57±0.04 vs 1.01±0.08,P<0.05)，miR-596具有顯著的抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用；Transwell穿孔實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-596胃癌細(xì)胞長(zhǎng)小孔的細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常胃癌細(xì)胞(0.59±0.10 vs 1.02±0.17,P<0.05)，miR-596對(duì)于胃癌細(xì)胞的侵襲具有顯著的抑制作用。

3 討 論

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國(guó)惡性腫瘤中發(fā)病率位居首位，臨床研究數(shù)據(jù)表明，胃癌好發(fā)于50歲以上的人群中。胃癌的發(fā)病會(huì)受到內(nèi)外部因素的影響，遺傳與基因、地域環(huán)境以及飲食結(jié)構(gòu)、細(xì)菌感染和癌前病變等，是影響胃癌發(fā)病的主要因素〔4，5〕。相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示，與胃癌患者具有血緣關(guān)系的人群中，胃癌的發(fā)病率高出4倍，胃癌的發(fā)生與發(fā)展和患者自身的抑癌基因、轉(zhuǎn)移基因及凋亡相關(guān)基因具有密切的關(guān)系〔6〕。胃癌患者中大部分屬于腺癌，且患者在患病早期大多數(shù)不會(huì)出現(xiàn)明顯癥狀，少數(shù)患者可能出現(xiàn)惡心、嘔吐及上消化道癥狀，臨床表現(xiàn)和胃炎、胃潰瘍等慢性疾病相似，常常被忽視，當(dāng)檢查確診胃癌時(shí)患者已處于病情較為嚴(yán)重的階段，對(duì)胃癌的早期診斷進(jìn)行優(yōu)化是十分必要的，對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和診治胃癌具有重要的意義〔7，8〕。老年胃癌相較于中青年患者來(lái)說(shuō)，其預(yù)后狀況相對(duì)較好，患者的腫瘤分化程度較高、侵襲性相對(duì)較弱。在臨床治療中，胃癌治療主要采取的方式有手術(shù)治療、化療、細(xì)胞靶向治療及免疫治療等，當(dāng)下大部分的胃癌治療方案中是將手術(shù)治療作為主要方式，并使用化療作為術(shù)后輔助治療，患者的復(fù)發(fā)率較高，術(shù)后患者的生存率無(wú)法得到有效保障〔9〕。

miRNA是一類內(nèi)源基因編碼長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能夠在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，目前為止，動(dòng)植物和病毒中發(fā)現(xiàn)的miRNA分子已達(dá)到28 000個(gè)以上〔10〕。相關(guān)研究顯示，miRNA在30%以上的基因及60%以上的蛋白中能夠產(chǎn)生調(diào)控作用，在細(xì)胞發(fā)育、增殖及凋亡活動(dòng)中能夠發(fā)揮重要作用。miRNA在癌癥發(fā)生與發(fā)展中的顯著作用逐漸被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，相關(guān)研究顯示，miR-29能夠?qū)?xì)胞周期蛋白CDC42表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，從而對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生促進(jìn)作用；而miR-190能夠?qū)ρ軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路進(jìn)行抑制，對(duì)于腫瘤新生血管的生成具有顯著的抑制作用；miR-125b能夠降低P53蛋白含量，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖作用〔11～13〕。隨著分子生物學(xué)的研究和在癌癥診治中的廣泛應(yīng)用，miRNA在癌癥診治中發(fā)揮愈加重要的作用，基于miRNA在腫瘤組織與正常組織中的表達(dá)差異，miRNA能夠成為腫瘤疾病診斷的重要標(biāo)志物，同時(shí)，基于miRNA在血液中的較強(qiáng)穩(wěn)定性，能夠通過(guò)對(duì)患者外周血中miRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)疾病進(jìn)行診斷和臨床指導(dǎo)〔14〕。部分miRNA表達(dá)與胃癌的負(fù)相關(guān)關(guān)系被逐漸發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，例如miRNA-935、miRNA-182等，均屬于具有抑癌性的miRNA，通過(guò)提升胃癌組織中的以上miRNA的表達(dá)水平，能夠起到胃癌控制與治療的作用〔15〕。

目前人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的miRNA分子已經(jīng)達(dá)到1 100條，并且其在癌癥疾病中能夠發(fā)揮重要的影響。相關(guān)研究中顯示，miR-596能夠?qū)谇话┘?xì)胞當(dāng)中的LGALS3-BP表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，從而對(duì)MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生影響，并降低癌細(xì)胞的增殖能力，對(duì)口腔癌病情發(fā)展產(chǎn)生積極影響〔16〕。另外，miR-596能夠?qū)Y(jié)腸癌患者的P53拮抗蛋白表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，從而提升P53蛋白水平，起到促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用。RT-PCR檢測(cè)方法是目前常用的癌細(xì)胞檢測(cè)方法，檢測(cè)的準(zhǔn)確性較高。本文中老年胃癌患者胃癌組織中miR-596相較于正常組織處于較低水平，表明miR-596低表達(dá)和老年胃癌患者的病情發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系，表明miR-596可以作為胃癌診斷的分子標(biāo)志物，為胃癌的早期檢查診斷提供更加科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊罁?jù)。同時(shí)，老年胃癌患者胃癌組織中miR-596的低表達(dá)，在一定程度上證實(shí)了miR-596可能存在一定的抗癌性，為老年胃癌的治療提供了更加廣泛的研究方向。

本研究結(jié)果進(jìn)一步表明了miR-596在老年胃癌患者中的抑癌作用，為疾病診斷、監(jiān)測(cè)及靶向治療提供了更加科學(xué)的依據(jù)。

腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲是影響腫瘤發(fā)展的重要因素，對(duì)miR-596在老年胃癌患者胃癌細(xì)胞增殖與侵襲中的作用進(jìn)行分析，能夠?yàn)榧膊〉脑\治提供更加科學(xué)的依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-596后胃癌細(xì)胞的增殖能力顯著下降，說(shuō)明miR-596具有顯著的抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用，這一作用的實(shí)現(xiàn)可能與其對(duì)MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生的作用機(jī)制是一致的。Transwell穿孔實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-596對(duì)于胃癌細(xì)胞的侵襲具有顯著的抑制作用。在臨床治療中，通過(guò)增加胃癌組織中的miR-596表達(dá)，能夠起到疾病控制與治療的作用。通過(guò)深入的靶基因預(yù)測(cè)技術(shù)以及相關(guān)研究，能夠?yàn)槔夏晡赴┑脑\治提供更加有效的方法。