崔均濤，劉鳳民，張偉麗

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教學(xué)科研基地，廣東 廣州 510225；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225）

【研究意義】 索邦（Sorbonne）和西伯利亞（Siberia）百合均屬于東方百合雜種系，為百合中的名貴品種群，由于其花色豐富、氣味芳香而深受人們喜愛，成為近年國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)熱銷的花卉種類之一，栽培面積也日益增長(zhǎng)，在切花生產(chǎn)中的地位也越來越重要。百合主要靠分球繁殖，繁殖系數(shù)低，傳統(tǒng)的鱗莖球繁殖方法繁殖速度緩慢，而離體培養(yǎng)繁殖速度快，有利于工廠化和規(guī)?；a(chǎn)[1]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，既能脫毒、又能加快其生長(zhǎng)發(fā)育周期，從而更好地利用其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)其潛力[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 近年來，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)多種百合進(jìn)行離體培養(yǎng)研究[3-8]，隨著東方百合在市場(chǎng)上越來越受歡迎，對(duì)東方百合的離體研究也逐漸增多[9-12]。龍彬等[13]研究表明，株洲紅東方百合的組培苗在-1 ℃條件下冷藏40 d為最佳并有助于煉苗成功。農(nóng)艷豐等[14]研究了東方百合甜夢(mèng)品種花器官的組織培養(yǎng)，結(jié)果表明花器官中子房最容易誘導(dǎo)愈傷組織，花柱、花藥次之，花托為最難誘導(dǎo)愈傷組織。目前東方百合的離體培養(yǎng)研究取得較大進(jìn)展，如針對(duì)索邦，不同研究所報(bào)道的適宜培養(yǎng)基配方不同。梁芳等[15]認(rèn)為，索邦百合最佳增殖培養(yǎng)基是MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基是MS+IBA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，分化培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基是MS+NAA 0.3 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+KT 0.2 mg/L；西伯利亞百合在MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖最佳，分化培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基是MS+IBA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L；以上兩個(gè)品種最佳生根培養(yǎng)基均為1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.01 mg/L。閆海霞等[16]研究表明，提伯（Tiber）、索邦和西伯利亞等3種東方百合愈傷誘導(dǎo)和分化的適宜培養(yǎng)基為MS，最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最適生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.1 mg/L?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 目前東方百合的離體培養(yǎng)研究雖然取得較大進(jìn)展，但是索邦、西伯利亞兩種東方百合遺傳轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)研究仍較少[17-18]。【擬解決的關(guān)鍵問題】 確定索邦和西伯利亞百合的離體再生系統(tǒng)適合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基以及最佳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，建立穩(wěn)定、高效的索邦和西伯利亞百合的離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為索邦百合和西伯利亞百合的無菌鱗莖球，購自中國(guó)芊卉種苗公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體滅菌 取百合鱗莖球先經(jīng)流水沖洗2 h，沖洗干凈后把鱗片葉剝下，選取分化能力最強(qiáng)、與鱗莖盤相連的下部柔嫩鱗片葉，剔除菌斑及瑕眥；用75%酒精浸泡30 s、無菌水漂洗后放入0.1% AgCl2（0.02%吐溫）中浸泡5～8 min，再用無菌水漂洗5次，濾紙吸干水分，切成3 mm×3 mm小塊作外植體，背面朝下接種在培養(yǎng)基上。在人工控制培養(yǎng)室中培養(yǎng)，先暗培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)溫度 22～26 ℃，光照度 2 000～2 200 Lx，光照12 h/d。

1.2.2 愈傷組織及芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 以MS為培養(yǎng)基，共設(shè)置11個(gè)不同的激素濃度組合，包括2,4-D（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）+6-BA 0.2 mg/L、2,4-D（1.0、1.5、2.0 mg/L）、6-BA（2.0、1.5、1.0、0.5 mg/L）+NAA 0.2 mg/L。然后附加蔗糖3%、瓊脂0.55%～0.65%，pH調(diào)至5.8，培養(yǎng)120 d，觀察其生長(zhǎng)狀況，60 d統(tǒng)計(jì)啟動(dòng)率，120 d統(tǒng)計(jì)植株出芽頻率、有效外植體平均出芽數(shù)和出苗平均高度。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)基篩選 接種60～90 d后誘導(dǎo)培養(yǎng)基中已長(zhǎng)出大量愈傷組織和芽叢，將愈傷組織和叢芽切割成0.5 cm×0.5 cm小塊，接入附加有不同激素配比（包括2,4-D 1.5 mg/L、2,4-D 1.0 mg/L、6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，定期觀察兩個(gè)品種在3個(gè)繼代培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，并統(tǒng)計(jì)芽增殖倍數(shù)、芽平均高度和生長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.4 根誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 將苗高3 cm以上且基部鱗莖球達(dá)到直徑3 mm的無菌苗，移至附加不同激素配比（包括NAA 0.1、0.2、0.3 mg/L，IBA 0.1、0.2 mg/L）的1/2MS培養(yǎng)基中，40 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)、根長(zhǎng)和生長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.5 煉苗移栽 待苗基部鱗莖球發(fā)育至直徑達(dá)3 mm時(shí)，即可敞開瓶口在培養(yǎng)室中煉苗。1周后，用流動(dòng)水清洗干凈根系上的培養(yǎng)基，移入噴灑過0.2%達(dá)克寧的基質(zhì)（沙∶花肥∶椰糠為1∶1∶1）中，溫度為25 ℃，平均光照2 000 Lx，每天光照12 h，15 d后再移入花盆或大田中生長(zhǎng)。

1.2.6 抗生素敏感實(shí)驗(yàn) 在獲得最適合兩種百合誘導(dǎo)增殖生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)5個(gè)卡那霉素濃度梯度（0、50、75、100、150 mg/L）。30 d后統(tǒng)計(jì)褐化率，觀察發(fā)芽表現(xiàn)，篩選轉(zhuǎn)化植株時(shí)卡那霉素的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)百合愈傷組織誘導(dǎo)的影響

百合鱗片塊接入培養(yǎng)基中約15 d左右，鱗片顏色由白色變成綠色，接種20 d時(shí)鱗片表面及切口處出現(xiàn)白色及淺綠色突起，即出現(xiàn)了黃綠色愈傷組織，主要集中在不定芽上。每個(gè)鱗片上有數(shù)個(gè)突起，接種40～45 d時(shí)突起部位長(zhǎng)出綠色芽叢，且鱗片基部出現(xiàn)愈傷組織并逐漸增大，至接種70～80 d時(shí)芽叢繼續(xù)長(zhǎng)高，而基部愈傷組織在生長(zhǎng)的同時(shí)又出現(xiàn)新的芽點(diǎn)及芽叢。繼續(xù)培養(yǎng)至120 d，可確定培養(yǎng)基各階段的誘導(dǎo)及伸長(zhǎng)芽的效率。

從表1可以看出，接種60 d時(shí)，索邦和西伯利亞在H4、H5、H11培養(yǎng)基上的啟動(dòng)率均高于其他培養(yǎng)基，百合在各誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的愈傷及芽生長(zhǎng)情況見圖1。接種120 d 時(shí)，在H1～H3等3種培養(yǎng)基中，兩種百合的植株出芽頻率和有效外植體平均出芽數(shù)均相對(duì)較低，甚至出芽數(shù)為0。在H4培養(yǎng)基中，索邦百合雖然植株出芽頻率為100%，但其有效外植體平均出芽數(shù)較低。兩種百合的植株出芽頻率和有效外植體平均出芽數(shù)均相對(duì)較低，甚至出芽數(shù)為0。而H5、H6、H7培養(yǎng)基中百合的有效外植體出芽數(shù)均大于5且出芽頻率都為100%，表明單獨(dú)使用2,4-D效果更好。索邦在H5、H6培養(yǎng)基中長(zhǎng)出鱗莖球，西伯利亞在H6、H7培養(yǎng)基中也長(zhǎng)出鱗莖球。H11培養(yǎng)中，百合的各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)均顯著高于H8、H9、H10、H11等4種培養(yǎng)基。綜上說明，索邦的最適芽誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)培養(yǎng)基是MS+2,4-D 1.0～2.0 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，西伯利亞的最適芽誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0～1.5 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

表1 不同激素配比對(duì)百合愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of different hormone ratios on callus induction of Lilium

圖1 索邦和西伯利亞百合在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的愈傷組織及芽生長(zhǎng)情況Fig.1 Callus and bud growth of Sorbonne and Siberia in different induction medium

2.2 不同激素配比對(duì)百合叢芽繼代增殖的影響

由表2可知，在MS+2,4-D 1.5 mg/L培養(yǎng)基中，索邦和西伯利亞百合的增殖倍數(shù)最高、分別為2.76和4.51，且芽平均高度也最高、分別為5.03和5.17，但兩種百合的長(zhǎng)勢(shì)均比MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中植株差。西伯利亞百合在MS+2,4-D 1.5 mg/L培養(yǎng)基中雖然分化出大量愈傷組織，但芽有畸形現(xiàn)象。而在MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中，百合苗較壯且沒有畸形，芽與愈傷組織的密度也較合適。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，兩種百合培養(yǎng)一個(gè)周期后，西伯利亞百合在僅含有2,4-D的培養(yǎng)基中叢芽發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，說明2,4-D對(duì)西伯利亞百合的抑制分化作用更明顯。綜合生長(zhǎng)狀況，我們認(rèn)為在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，兩種百合繁殖出的愈傷組織和叢芽更健壯、密度也更合適。

表2 不同激素配比對(duì)百合叢芽繼代增殖的影響Table 2 Effects of different hormone ratio on subculture proliferation of Lilium cluster buds

2.3 不同激素配比對(duì)百合根誘導(dǎo)及移栽的影響

由表3可知，索邦和西伯利亞的根誘導(dǎo)培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果比較一致，在添加NAA 0.1～0.3 mg/L的MS培養(yǎng)基中，MS+NAA 0.2 mg/L中百合的平均根長(zhǎng)度顯著高于其他兩種培養(yǎng)基，索邦和西伯利亞分別為1.13、3.70，平均生根數(shù)次于MS+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基，且植株生長(zhǎng)勢(shì)好、根系粗壯。雖然MS+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基中百合平均生根數(shù)最高，但是植株生長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)于其他兩種培養(yǎng)基較為弱。MS+IBA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中百合的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于MS+IBA 0.2 mg/L，且植株生長(zhǎng)勢(shì)好、根系粗壯。綜合生根數(shù)、平均根長(zhǎng)度和植株生長(zhǎng)勢(shì)，效果較好的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L，IBA和NAA對(duì)促進(jìn)百合生根效果相仿。

表3 不同激素配比對(duì)百合根誘導(dǎo)及移栽的影響Table 3 Effects of different hormone ratios on the rooting induction and transplanting of Lilium

2.4 卡那霉素抗性篩選

從表4可以看出，隨著卡那霉素質(zhì)量濃度的升高，兩種百合褐化率上升、發(fā)芽數(shù)減少，外植體的生長(zhǎng)和分化受到不同程度的影響。當(dāng)卡那霉素質(zhì)量濃度較低時(shí)，兩種百合發(fā)芽正常，當(dāng)卡那霉素質(zhì)量濃度為150 mg/L時(shí)，兩種百合褐化率分別高達(dá)100%和98%，無芽發(fā)生且芽呈黑褐色?？梢姡敲顾刭|(zhì)量濃度越高，兩種百合均表現(xiàn)為發(fā)芽減少并呈萎縮趨勢(shì)，150 mg/L濃度能起到抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的效果。

表4 百合鱗片對(duì)卡那霉素的抗性Table 4 Resistance of Lilium scales to Kanamycin

3 討論

3.1 不同激素配比對(duì)百合叢芽的影響

通過對(duì)索邦和西伯利亞百合離體快繁結(jié)果表明，在促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代增殖、生根培養(yǎng)中，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇及其濃度都會(huì)影響芽的生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)索邦和西伯利亞在添加2,4-D的MS培養(yǎng)基中出芽效果更好，說明在適宜濃度下單獨(dú)使用2,4-D比組合使用6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L對(duì)百合叢芽持續(xù)生長(zhǎng)的效果更明顯，但其綜合生長(zhǎng)狀況卻不及組合激素發(fā)揮穩(wěn)定。因此，單獨(dú)使用2,4-D對(duì)百合分化芽的生長(zhǎng)狀況比再加入6-BA強(qiáng)，這與前人試驗(yàn)結(jié)果[19]相一致。在組合激素培養(yǎng)基中百合幼苗更加健壯，不易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。此外，本試驗(yàn)還觀察到的6-BA在愈傷組織分裂中的作用，6-BA濃度過高（2.0 mg/L）會(huì)導(dǎo)致百合出苗長(zhǎng)勢(shì)變差，相對(duì)適宜的6-BA濃度為0.5 mg/L。我們認(rèn)為，6-BA和NAA在百合增殖和生根中的作用是協(xié)同的，任意一種濃度過高或過低后會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)不良，兩者比例合適時(shí)才能發(fā)揮最大效果。

3.2 百合轉(zhuǎn)基因研究、抗生素對(duì)百合的敏感影響

目前，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行百合轉(zhuǎn)基因研究中，大多采用的是在室外生長(zhǎng)的鱗片葉進(jìn)行消毒，然后與農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)[20]，此法的最大缺點(diǎn)是污染率高，表面消毒對(duì)供試材料具有一定傷害，從而造成褐化，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。而本研究采用組織培養(yǎng)的方式，將鱗片葉直接作為基因轉(zhuǎn)化受體材料，建立直接分化再生系統(tǒng)，此法的優(yōu)勢(shì)在于取材不受季節(jié)和氣候的影響，且沒有外植體污染問題，從而提升了轉(zhuǎn)化效率。

唐東芹等[21]認(rèn)為，在基因轉(zhuǎn)化過程中百合外植體不能連續(xù)被分割，且在篩選培養(yǎng)基時(shí)抗生素會(huì)使有切口的外植體褐化并導(dǎo)致死亡，因此要保證外植體的完整性。說明百合再生能力強(qiáng)且適合離體培養(yǎng)，若以鱗片為外植體，其直接分化率高、分化周期短且分化能力強(qiáng)，是外植體穩(wěn)定來源之一卡納霉素的使用能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)菌的生長(zhǎng)，并且不影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)效果，但轉(zhuǎn)化篩選時(shí)必須保證外植體的完整性，防止傷口惡化。鱗片葉再生過程中，NAA和6-BA組合對(duì)鱗片葉再生效果好，且分化率高，可作為良好的受體。

4 結(jié)論

本研究以百合鱗莖片為外植體，比較了不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基的誘導(dǎo)、繼代增殖、生根效果。結(jié)果表明，索邦百合的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS+2，4-D 1.5～2.0 mg/L，西伯利亞百合是2，4-D 1.0～1.5 mg/L；兩種百合的最佳繼代培養(yǎng)基均為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基均為1/2MS+NAA 0.2 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L。以百合鱗莖片為受體系統(tǒng)而篩選轉(zhuǎn)化植物時(shí)，卡那霉素最佳質(zhì)量濃度為150 mg/L。本研究確定了兩種百合的離體再生體系的技術(shù)參數(shù)，誘導(dǎo)培養(yǎng)開始7 d為暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)60～90 d后，分割芽叢或新形成的小鱗莖片后接入繼代培養(yǎng)基中繼代45 d，再生根培養(yǎng)40～50 d，當(dāng)芽苗高度達(dá)3 cm且新形成鱗莖球直徑達(dá)3 mm時(shí)，煉苗7 d，然后移至基質(zhì)（沙∶花肥∶椰糠為1∶1∶1）生長(zhǎng)15 d后移入花盆或大田中生長(zhǎng)。本研究結(jié)果可為東方百合品種種球工廠化生產(chǎn)及遺傳轉(zhuǎn)化再生體系提供充實(shí)理論依據(jù)。