張佳嬋，王昌濤，孫寶國，4，*，王成濤，楊帆

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.北京工商大學(xué)北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；3.北京工商大學(xué)植物資源研究開發(fā)北京市重點實驗室，北京 100048；4.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；5.云南白藥集團股份有限公司，云南 昆明 650000）

紅曲霉是一種重要的藥食兩用微生物資源，在我國應(yīng)用紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲米，已經(jīng)有上千年的歷史，近現(xiàn)代發(fā)展也產(chǎn)生其他多種食品，紅曲黃酒、腐乳、醬菜、果酒等[1-2]。此外，紅曲霉還用于保健和醫(yī)藥領(lǐng)域，紅曲霉具有多種有益成分，如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽、γ-氨基丁酸、支鏈氨基酸、紅曲紅色素、紅曲黃色素等，其中又以Monacolin K 最為重要[3-5]。早在上世紀80年代，日本學(xué)者從紅色紅曲霉中分離出了一系列Monacolin 活性成分，被統(tǒng)稱為他汀同系物（Monacolins）。這些他汀類物質(zhì)具有顯著的降血脂功效，能夠顯著降低人體內(nèi)源性膽固醇的合成，抑制細胞內(nèi)膽固醇的貯存；能夠顯著降低血液中低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDLC）的含量，有效預(yù)防動脈粥樣硬化，具有高效、低度和安全的特點[6]。但是微生物產(chǎn)Monacolin K 的產(chǎn)率很低，需用稻米為發(fā)酵基質(zhì)，生產(chǎn)成本較高，限制了它的廣泛應(yīng)用。

為了能夠提高Monacolin K 的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，廣大科研工作者逐漸嘗試并開展了發(fā)酵添加物或其他低成本基質(zhì)在生產(chǎn)Monacolin K 上的應(yīng)用。柴詩緣等探索了10 種添加物對紅曲霉Monacolin K 產(chǎn)量的促進效果，發(fā)現(xiàn)添加谷氨酸可以顯著提高Monacolin K的產(chǎn)量[7]。碳氮比是微生物固體發(fā)酵中的重要考量因素，碳氮比的差異影響著微生物次級代謝產(chǎn)物的積累[8]。陳勉華等利用不同發(fā)酵基質(zhì)發(fā)酵紅曲霉，觀測其對不同次級代謝產(chǎn)物的影響，研究發(fā)現(xiàn)大米復(fù)配麥麩較單純使用大米為發(fā)酵基質(zhì)的紅曲產(chǎn)品，其Monacolin K 的含量增加了1 倍[9]。此外，也有部分學(xué)者力求通過基因改造、物理誘變等手段選育高產(chǎn)紅曲霉次級代謝產(chǎn)物的菌株，也取得了一定的效果，但誘變菌株活力易衰減、條件不可控，此類技術(shù)還不成熟[10]。也有研究者發(fā)現(xiàn)不同封口方式對紅曲霉產(chǎn)Monacolin K 的含量也有影響[11]。

利用農(nóng)林副產(chǎn)物作為發(fā)酵基質(zhì)用于微生物次級代謝產(chǎn)物或菌體的生產(chǎn)方式已有多年發(fā)展歷史。應(yīng)用于發(fā)酵的農(nóng)副廢料有畜禽羽毛[12]、稻草[13]、玉米芯[14]、藻類[15]、面包屑[16]、廚余殘渣[17-18]以及果皮[19-20]等。以紅曲霉為菌種的固體發(fā)酵農(nóng)副廢料的研究也迅速開展。Babitha 等利用波羅蜜種子進行紅曲霉的固體發(fā)酵用于紅曲色素的生產(chǎn)并確定了發(fā)酵工藝[21]；Srianta 等將多種谷物基質(zhì)應(yīng)用在紫紅曲霉（Monascus purpureus）的發(fā)酵中，探討了多種基質(zhì)對菌絲生長狀態(tài)、色素產(chǎn)量以及基質(zhì)活性成分變化的影響，發(fā)現(xiàn)去殼高粱粒更有助于菌絲的生長和色素的積累[22]。Wang 等將赤紅曲霉（Monascus anka GIM 3.592）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae GIM 2.139）混合發(fā)酵番石榴葉以獲得多酚類提取物[23]。這些研究的目的多為獲得色素、酶類或改善基質(zhì)條件，較少以Monacolin K 為目的產(chǎn)物的副產(chǎn)物發(fā)酵研究。

沙棘籽粕（sea bucthorn seed residues，SBSR）是沙棘籽脫油后的副產(chǎn)物，常被作為飼料喂養(yǎng)畜牧或直接丟棄。通過測定發(fā)現(xiàn)，沙棘籽粕富含豐富的纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，可以被微生物所利用，將其應(yīng)用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。本課題將沙棘籽粕與紅曲霉相結(jié)合，通過輔料的添加來達到生產(chǎn)Monacolin K 的目的，并通過改變發(fā)酵條件，探索發(fā)酵基質(zhì)活性成分的變化趨勢。本課題的成功實施有望降低生產(chǎn)成本，擴大紅曲霉的底物發(fā)酵范圍，為Monacolin K 的生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲霉菌株（Monascus Purpureus）M1：北京工商大學(xué)植物資源研究開發(fā)北京市重點實驗室保存；沙棘籽粕：青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰荆痪?、糯米：五常市彩橋米業(yè)有限公司；燕麥米：遼寧巨龍有機食品有限公司；薏仁米：朝陽泰然科技食品有限公司；蘆丁、原花青素、牛血清蛋白：中國藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、鄰二氮菲：分析純，北京化工廠；氯化鈉、硫酸銅、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Monacolin K（純度≥98%）；Sigma 公司。

BS2202S 型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DSHZ-300 恒溫水浴振蕩器：江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠；RJ-LD-50C 低速大容量多管離心機：無錫瑞江分析儀器有限公司；T6 新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SCB-920 潔凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司；20A 型高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 輔料的篩選

以沙棘籽粕為主要發(fā)酵基質(zhì)，以Monacolin K 含量和生長速度為指標，篩選出高產(chǎn)Monacolin K 的發(fā)酵輔料。

根據(jù)物料成分的特點，從粳米、糯米、薏仁米和燕麥米4 種常見稻米中篩選合適的輔料。配制發(fā)酵營養(yǎng)液（磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%），為發(fā)酵基質(zhì)提供必要的礦物質(zhì)元素。固定輔料與沙棘籽粕為1∶1（g/g），提前混勻后，在粗平底試管中進行生長速度的測定。以每管25 g 輔料來計算，分裝在4 根大試管中，添加25 mL 營養(yǎng)液使含水量為50%。透氣膜及報紙封口，121 ℃滅菌1 h。接種相同批次、相同大小的紅曲霉固體培養(yǎng)基，記號筆標記發(fā)酵起點。一定時間后標記菌絲延伸長度，并記錄發(fā)酵天數(shù)。

1.2.2 生長速度的測定

固定輔料與沙棘籽粕為1∶1（g/g），在粗平底試管中進行生長速度的測定。具體準備方法見1.2.1。待菌絲延伸至中間位置，記錄生長天數(shù)及生長距離，計算生長速度。

1.2.3 Monacolin K 的提取及測定

將發(fā)酵結(jié)束的固體菌質(zhì)于121 ℃滅菌1 h 后，取出置于45 ℃條件下烘干并粉碎。將1.00 g 干物質(zhì)置于15 mL75%的甲醇中，超聲 20 min，過 0.45 μm 濾膜，收集于液相小瓶中。

利用高效液相色譜進行Monacolin K 含量的測定。色譜條件如下，色譜柱 C18（5 μm，150 mm×4.6 mm），流動相為甲醇：0.1%磷酸=3∶1（體積比），柱溫 30 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL。將標準品Monacolin K用無水甲醇配制成一系列濃度（5、20、50、80、100、150、200 μg/mL）溶液后進行測定，繪制濃度—峰面積標準曲線。樣品以相同方法進行測定，所得峰面積帶入標準曲線換算成含量。

1.2.4 不同輔料比例條件下水溶性和醇溶性活性成分的變化

固定含水量為60%，發(fā)酵時間為15 d，接種量為1 mL（孢子懸液濃度 3.2 × 104/mL），探討沙棘籽粕/輔料為 1∶0、2∶1（1∶0.5）、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、0∶1（g/g）時，對水溶性成分和醇溶性成分含量的影響，以未接種的發(fā)酵基質(zhì)為空白。

將發(fā)酵結(jié)束的固體菌質(zhì)于121 ℃滅菌1 h 后，取出置于45 ℃條件下烘干并粉碎。取1.00 g 干物質(zhì)以1∶8（g/mL）比例添加蒸餾水，90 ℃ 熱水浸提 5 h。離心取上清液測定水溶性活性成分（總糖和多肽）和醇溶性活性成分（原花青素、總酚和黃酮）的含量。

1.2.5 不同含水量條件下水溶性和醇溶性活性成分的變化

固定沙棘籽粕/輔料比例（1∶1 g/g），發(fā)酵時間為15 d，接種量為1 mL（孢子懸液濃度3.2×104/mL），探討不同含水量（40%、50%、60%、70%和80 %）對水溶性活性成分（總糖和多肽）和醇溶性活性成分（原花青素、總酚和黃酮）的影響，以未接種的發(fā)酵基質(zhì)為空白。發(fā)酵后的菌質(zhì)處理方式及上清液制備方法見1.2.4。

1.2.6 不同發(fā)酵時間水溶性和醇溶性活性成分的變化

固定含水量為60%，接種量為1 mL（孢子懸液濃度 3.2× 104/mL）和沙棘籽粕/輔料比例（1∶1 g/g），探討不同發(fā)酵時間對水溶性活性成分（總糖和多肽）和醇溶性活性成分（原花青素、多酚和黃酮）的影響，以未接種的發(fā)酵基質(zhì)為空白。發(fā)酵后的菌質(zhì)處理方式及上清液制備方法見1.2.4。

1.2.7 活性成分的測定方法

水溶性活性成分總糖和多肽的測定方法參照參考文獻[24]和[25]；醇溶性活性成分原花青素、黃酮和多酚含量的測定分別參照參考文獻[26]、[24]、[27]。上述結(jié)果均以mg/g DW 表示。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用單因素ANOVA 分析，兩兩比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所得結(jié)果以±s 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 輔料的篩選

微生物生長需要必須的碳源、氮源、礦物質(zhì)元素、生長因子等。沙棘籽粕纖維素、多肽含量豐富，可以為微生物提供必要的營養(yǎng)元素。預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，單純沙棘籽粕可以被紅曲霉所利用，但是并不利于次級代謝產(chǎn)物Monacolin K 的積累，然而通過添加一定量的輔料有利于Monacolin K 的生成。圖1為本試驗所選4 種輔料的添加對Monacolin K 含量和菌絲生長速度的影響。

圖1 添加不同輔料對生長速度和Monacolin K含量的影響Fig.1 Effects of different ingredients on growth rate and the content of Monacolin K

由圖1可知，4 種輔料的添加均不影響菌絲的生長，其中，粳米、燕麥米和薏仁米的添加顯著提高了菌絲生長速度（P＜0.01），糯米的添加與“無”輔料組的生長速度無顯著差異（P＞0.05）。Monacolin K 含量因添加輔料而顯著增加（P＜0.05），其中燕麥米的增加最為顯著（P＜0.01），達到（1 836.88±128.58）μg/g DW。鑒于生長速度與特征性活性成分Monacolin K 的雙重考量，選擇燕麥米為后續(xù)試驗輔料。

2.2 不同發(fā)酵條件對生長速度及Monacolin K含量的影響

為了明確不同發(fā)酵條件對生長速度和Monacolin K 的影響，本試驗探討了輔料比例、基質(zhì)含水量和發(fā)酵時間3個重要因素對生長速度和Monacolin K 的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同發(fā)酵條件對生長速度和Monacolin K含量的影響Fig.2 Effects of different conditions on growth rate and the content of Monacolin K

由圖2A 可知，沙棘籽粕/燕麥米的比例影響了生長速度和Monacolin K 的含量，隨著燕麥米所占比例的增大，Monacolin K 的含量呈上升趨勢，由最初的（32.77±12.83）μg/g DW 升高至（2 972.18±15.66）μg/g DW，說明燕麥米有助于紅曲霉次級代謝產(chǎn)物的積累；并且，隨著燕麥米所占比例的增大，菌絲生長速度也存在著先升高后降低的趨勢，追究原因可能是由于適量的燕麥米為紅曲霉提供了豐富的單糖、雙糖等，有助于紅曲霉的直接利用，當燕麥米占據(jù)發(fā)酵基質(zhì)的100%時，黏度的增加減少了基質(zhì)中的氧氣，不利于菌絲的分裂增長，生長速度下降。

圖2B 探討了含水量對生長速度和Monacolin K含量的影響。在所探討試驗范圍內(nèi)，60%含水量能夠達到最大的生長速度（0.42±0.04）cm/d，Monacolin K 的積累量也達到最高（1 836.88±17.73）μg/g DW。本試驗中，80%含水量使發(fā)酵菌質(zhì)全部浸泡于發(fā)酵營養(yǎng)液中，發(fā)酵基質(zhì)含氧量稀少，不利于紅曲霉菌絲的延伸和次級代謝產(chǎn)物的積累。

Monacolin K 在發(fā)酵過程中的積累結(jié)果見圖2C。隨著發(fā)酵時間的延長，Monacolin K 的含量逐漸升高，并于第5天開始迅速積累，含量達到（460.15±17.72）μg/g DW，Monacolin K 含量在第17天達到最高，（2 418.53±86.20）μg/g DW，17 d～21 d 的積累量變化不顯著。車鑫[28]在研究中藥對固體發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K 的影響研究中對照了普通發(fā)酵紅曲的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)紅曲固體發(fā)酵產(chǎn)Mona colin K 的含量在1.5 mg/g DW 左右，顯著低于本結(jié)果。

2.3 不同添加比例對活性成分含量的影響

設(shè)定沙棘籽粕/燕麥米的比例為 1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（g/g）和 0∶1 7（g/g）個梯度，以未接種的滅菌基質(zhì)為空白對照，觀察不同比例下發(fā)酵15 d 后的終產(chǎn)物醇溶性和水溶性活性成分的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同輔料比例對活性成分含量的影響Fig.3 Effects of ratios on the contents of active ingredients

隨著燕麥米所占比例的增加，發(fā)酵前后原花青素的含量均呈下降趨勢，且發(fā)酵后的樣品組與空白對照組相比無顯著性差異；總酚與黃酮的變化趨勢類似，燕麥米的比例較大時，發(fā)酵后的總酚和黃酮含量顯著高于發(fā)酵前；發(fā)酵前后總糖和多肽含量的變化趨勢均隨著燕麥米所占比例的增大而升高；同一輔料比例下，紅曲霉的作用更有助于糖分和多肽的溶出，兩者含量與發(fā)酵前相比總體呈升高趨勢，但是在輔料比例2∶1（g/g）時，總糖的含量低于發(fā)酵前，原因可能是較低含量的燕麥米所含糖分剛好被紅曲霉利用，且還沒有利用基質(zhì)中的纖維素類的原因。

2.4 不同含水量對活性成分含量的影響

不同含水量對活性成分含量的影響見圖4。

含水量是微生物生長的關(guān)鍵因子，適量的含水量有助于微生物的生長繁殖和次級代謝產(chǎn)物的積累。固體基質(zhì)中過高的含水量降低了基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)，阻斷的氧氣的滲透；較低的含水量則不利于微生物的生長，限制了能量的傳遞和代謝產(chǎn)物的溶出。因80%含水量條件下，固體基質(zhì)全部浸泡在發(fā)酵營養(yǎng)液中，微生物不能生長（圖2B 所示），故在探討微生物對基質(zhì)中活性成分的影響時舍棄此條件。

圖4 不同含水量對活性成分含量的影響Fig.4 Effects of different water contents on the contents of active ingredients

前期研究結(jié)果（圖2B）顯示，60%含水量下紅曲霉的生長速度最大，低于60%含水量時，隨著含水量的增加，微生物逐漸快速生長，體內(nèi)各種分解酶活力升高，使基質(zhì)中醇溶性物質(zhì)原花青素、總酚和黃酮均低于發(fā)酵前；高于60%含水量時，微生物不能正常生長，使得部分活性物質(zhì)（原花青素、總酚、黃酮和多肽）得以保留；發(fā)酵后的總糖含量在40%含水量時高于發(fā)酵前含量，可能是紅曲霉分解了纖維素類屏障類物質(zhì)使糖分溶出的結(jié)果，而在50%～70%含水量范圍內(nèi)均低于發(fā)酵前，可能是因為微生物的快速生長導(dǎo)致溶出的糖分進一步被利用。

2.5 不同發(fā)酵時間對活性成分含量的影響

本試驗探討了醇溶性和水溶性活性成分隨發(fā)酵時間的變化趨勢，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，原花青素和總酚含量均在發(fā)酵初始時含量最高，隨著發(fā)酵時間的延長而呈下降趨勢，說明在微生物的生長過程中不利于兩者的保留；黃酮含量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，并于第15天時達到最高，（1.00±0.07）mg/g DW，該趨勢的呈現(xiàn)可能是由于在發(fā)酵前期微生物逐漸分解纖維素等屏障性物質(zhì)，使黃酮更易溶出，隨著發(fā)酵的延長，被微生物進一步利用的緣故；總糖含量的變化趨勢與黃酮略有相反，發(fā)酵初期因微生物的生長消耗糖分，使總糖含量逐漸降低，隨著發(fā)酵延長，微生物逐漸分解纖維素類等屏障性物質(zhì)而產(chǎn)生供其利用的糖分，從而使總糖含量逐漸升高，當微生物數(shù)量逐漸增多到一定程度，微生物的消耗與微生物菌種本身的糖類達到動態(tài)平衡，而呈現(xiàn)最終趨于平緩的趨勢。

圖5 發(fā)酵時間對活性成分含量的影響Fig.5 Effects of fermentation time on the contents of active ingredients

3 結(jié)論

紅曲霉可以直接利用沙棘籽粕進行生長繁殖，但是單純沙棘籽粕并不利于Monacolin K 的積累；以菌絲生長速度和Monacolin K 含量為指標進行輔料的篩選，發(fā)現(xiàn)燕麥米是兩者兼顧的最優(yōu)輔料。當沙棘籽粕/燕麥米為 1∶4（g/g）時，菌絲生長速度最大（0.69±0.02）cm/d，且Monacolin K 隨著燕麥米所占比例的增大而呈上升趨勢；60%含水量下，菌絲生長速度和Monacolin K 含量達到峰值；在所考察發(fā)酵進程中，Monacolin K 含量在 17 d 后達到最大值（2 418.53±86.20）μg/g DW。

在不同的發(fā)酵條件下，發(fā)酵菌質(zhì)中活性成分的含量與微生物的生長狀態(tài)緊密相關(guān)。極端環(huán)境下，微生物的生長受到限制，使基質(zhì)中的活性成分得以保留，但同時也因微生物對基質(zhì)的分解作用微弱，使活性成分不易被提取和檢測到；適宜環(huán)境下，微生物的生長狀態(tài)良好，基質(zhì)中的活性成分（如糖分）被分解消耗，但同時也因微生物本身數(shù)量的增加使最終發(fā)酵菌質(zhì)中的活性成分含量升高。在每個發(fā)酵階段，發(fā)酵菌質(zhì)的活性物質(zhì)含量此消彼長，均可大致歸為上述原因。