王永芳，王利強(qiáng)，溫華蔚

（天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300461）

氟蟲(chóng)腈是一種苯基吡唑類(lèi)廣譜殺蟲(chóng)劑[1]，氟蟲(chóng)腈的代謝產(chǎn)物主要有氟蟲(chóng)腈亞砜、氟蟲(chóng)腈砜、氟甲腈3種，對(duì)蚜蟲(chóng)、葉蟬、飛虱、鱗翅目幼蟲(chóng)、蠅類(lèi)和鞘翅目等重要害蟲(chóng)有很高的殺蟲(chóng)活性，對(duì)作物無(wú)藥害，但由于氟蟲(chóng)腈代謝產(chǎn)物的毒性比母體大很多[2]，有些國(guó)家也禁止使用氟蟲(chóng)腈進(jìn)行防蟲(chóng)[3-4]。氟蟲(chóng)腈可能會(huì)損害肝臟、甲狀腺和腎臟，但不會(huì)引起基因突變、致癌或?qū)ι衬芰?、胎兒造成影響。氟蟲(chóng)腈主要用于對(duì)跳蚤、虱子、蟑螂、螨、螞蟻等蟲(chóng)害的防治。畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中禁止使用該類(lèi)殺蟲(chóng)劑。全球也對(duì)雞蛋中氟蟲(chóng)腈殘留量更加地關(guān)注。

基于氟蟲(chóng)腈的危害性和風(fēng)險(xiǎn)性，禁止在用于食品加工的動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中使用氟蟲(chóng)腈。國(guó)際食品法典（Codex Alimentarius Commission，CAC）和日本食品安全標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，氟蟲(chóng)腈在蛋中的最大殘留限量為0.02 mg/kg；美國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，氟蟲(chóng)腈在蛋中的最大殘留限量為0.03 mg/kg；歐盟規(guī)定：雞蛋和雞肉中氟蟲(chóng)腈最大殘留限量為0.005 mg/kg。國(guó)內(nèi)GB 2763-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥最大殘留限量》中明確了氟蟲(chóng)腈在谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、糖類(lèi)和食用菌中的限量[5]（玉米及鮮食玉米0.1 mg/kg，其他為0.02 mg/kg），對(duì)于其在蛋類(lèi)和肉類(lèi)中的最大殘留限量沒(méi)有做出規(guī)定。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于食品中氟蟲(chóng)腈檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中[6-8]，未涉及到雞蛋的檢測(cè)。目前關(guān)于雞蛋等動(dòng)物性產(chǎn)品中氟蟲(chóng)腈檢測(cè)方法的文獻(xiàn)越來(lái)越多，涉及到的方法有氣相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-13]、液相色譜質(zhì)譜法[14-17]，上述方法只是檢測(cè)雞蛋中或者雞蛋及蛋制品中氟蟲(chóng)腈及代謝物的測(cè)定，本研究建立一個(gè)既適用于雞蛋、蛋制品，又適用于雞肉的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測(cè)方法。通過(guò)建立該方法，可以對(duì)進(jìn)口雞蛋、蛋制品和雞肉進(jìn)行有效把關(guān)，同時(shí)對(duì)保障國(guó)內(nèi)雞蛋、蛋制品和雞肉的質(zhì)量安全具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

雞蛋、雞肉、蛋糕：市售。

氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜：純度＞98.0%，德國(guó) Dr.Ehrensorfer 公司；乙腈：色譜純，迪馬科技有限公司；正己烷：色譜純，默克股份兩合公司；丙酮：色譜純，默克股份兩合公司；乙酸銨：分析純，天津風(fēng)船試劑科技有限公司；無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸：迪馬科技公司；Cleanert PEP Plus（60 mg/3 mL）：博納艾杰爾科技有限公司；Florisil 固相萃取柱、C18 固相萃取柱：美國(guó)Supelco 公司。含10 mmol 乙酸銨的0.1%甲酸-水溶液：稱(chēng)取0.78 g 乙酸銨，溶解于1 L 高純水中，再加入1 mL 甲酸，搖勻，常溫保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

6460 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：安捷倫科技有限公司；B-100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士 Buchi 公司；Milli-Q Advantage A10 純水儀：美國(guó) Millipore 公司；PL602-L 電子天平：梅特勒-托利多公司；Promax-2020 型水瓶往復(fù)振蕩器：德國(guó)Heidolph 公司；Model 231 渦旋式振蕩器：美國(guó) Scientific Industries 公司；Ultra-turrax T25 均質(zhì)器：Janke & Kunkel IKA-labortechnik；攪蛋器、粉碎機(jī)：美的集團(tuán)有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 mg（精確至0.1 mg）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成1 000 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃冰箱進(jìn)行保存。工作液的配制：根據(jù)試驗(yàn)的需要，用相應(yīng)的空白基質(zhì)溶液配制成一系列濃度的工作液。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Eclipse C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：0.1 %甲酸乙腈（A）和添加10 mmol 乙酸銨和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Elution gradient of mobile phase

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓：4 000 V；霧化氣壓力：2.7×105Pa 離子源溫度：350 ℃；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、毛細(xì)管出口電壓、碰撞能量，見(jiàn)表2。

表2 氟蟲(chóng)腈及其代謝物色譜質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometer parameters of fipronil and its metabolites

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 樣品提取

雞蛋去殼后，用攪蛋器充分?jǐn)噭?，備用；將雞肉、蛋糕用粉碎器粉碎均勻，備用。取2 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL 離心管中，雞蛋樣品中加水1 mL，雞肉和蛋糕中加水5 mL，渦旋振蕩2 min，加入含1%甲酸乙腈10 mL，渦旋混勻后，進(jìn)行超聲輔助提取10 min，加入 1 g NaCl，渦旋 1 min，8 000 r/min 離心 5 min，上清液待凈化。

1.2.4.2 樣品凈化

取上述待凈化提取液2 mL，加入到PEP Plus 萃取柱中，前0.5 mL 流出液棄去，收集剩余的上樣流出液。取出0.5 mL 收集液，再向其中加入0.5 mL 水，混勻后，過(guò) 0.22 μm 過(guò)濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氟蟲(chóng)腈及其代謝物為中等偏弱極性化合物，通過(guò)參考文獻(xiàn)資料[18-21]，目標(biāo)物在C18 色譜柱上應(yīng)具有較強(qiáng)保留，本試驗(yàn)最終選擇Eclipse C18 色譜柱，考慮到基質(zhì)中雜質(zhì)的影響，為使目標(biāo)化合物獲得較好的分離和峰形，降低基質(zhì)效應(yīng)的干擾，本方法選取梯度洗脫模式，比對(duì)乙腈-水、甲醇-水、乙腈（含0.1 % 甲酸）-10 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），通過(guò)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行考察，采用0.1%甲酸的乙腈作為有機(jī)相，含有10 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸水溶液作為水相，目標(biāo)化合物可以很好的基線(xiàn)分離，獲得很好的峰形，確定為最終的液相條件。

本方法采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），氟蟲(chóng)腈及代謝物結(jié)構(gòu)中含有較多鹵代基，在源內(nèi)易形成負(fù)離子，在負(fù)離子模式下有更好的響應(yīng)，因此采用ESI-作為電離條件；配制50 ng/mL 的氟蟲(chóng)腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)樣確定質(zhì)譜參數(shù)。先對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，確定其分子離子峰[M-H]-作為母離子，以母離子響應(yīng)為指標(biāo)，分別對(duì)毛細(xì)管出口電壓進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，選取響應(yīng)最強(qiáng)的兩個(gè)子離子，分別和母離子組合確定為定量離子對(duì)和定性離子對(duì)，并進(jìn)一步優(yōu)化碰撞電壓使各個(gè)離子對(duì)信號(hào)響應(yīng)最強(qiáng)，確定為各自的定量參數(shù)（見(jiàn)表2）。在該優(yōu)化條件下，雞蛋樣品和雞蛋樣品中添加1 μg/kg 濃度的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM）色譜圖，見(jiàn)圖1和圖2。

2.2 提取條件的選擇和優(yōu)化

氟蟲(chóng)腈為中等偏弱極性殺蟲(chóng)劑，在提取過(guò)程中易溶于有機(jī)試劑，本試驗(yàn)基質(zhì)中雞蛋、雞肉的主要成分為水，約占70%，其次雞蛋中蛋白含量約占15%，脂肪約為12%，雞肉中蛋白含量約占20%，脂肪含量約占2.5%，蛋糕中的主要原料含有雞蛋、白糖、小麥粉等，根據(jù)基質(zhì)的特點(diǎn)：含有水分、蛋白和脂肪，選擇合適的提取溶劑。加入提取溶劑之前加入適量的水，與基質(zhì)充分混勻，將基質(zhì)分散，利于有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷是常用的提取溶劑，丙酮和乙酸乙酯在提取目標(biāo)物的同時(shí)，也會(huì)萃取出含量較高的脂肪，不利于下一步凈化處理，乙腈在提取過(guò)程中，能很好的沉淀蛋白，減少脂肪和其他雜質(zhì)的溶出，加入適當(dāng)濃度的酸，能減少基質(zhì)對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物的干擾，加入適量NaCl 鹽析后更好地進(jìn)行凈化。本試驗(yàn)采用含1%甲酸的乙腈作為提取溶劑。

圖1 雞蛋樣品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of egg sample

圖2 4種化合物的MRM色譜圖（1 μg/kg）Fig.2 MRM chromatograms of 4 compounds（1 μg/kg）

2.3 凈化條件的選擇和優(yōu)化

目標(biāo)物氟蟲(chóng)腈及代謝物在提取過(guò)程中，將基質(zhì)中少量的油脂、蛋白等成分提取出來(lái)，通過(guò)凈化，可以去除這些雜質(zhì)的干擾，使得目標(biāo)物分離的更好，同時(shí)減少雜質(zhì)對(duì)儀器的污染。選擇Florisil 固相萃取柱、Cleanert PEP Plus 固相萃取柱，C18 固相萃取柱，通過(guò)回收率試驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同凈化柱對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物回收率的影響Fig.3 Comparison of recoveries using different clean-up column

Cleanert PEP Plus 柱在凈化過(guò)程中無(wú)需進(jìn)行活化和洗脫，相比Florisil 固相萃取柱、C18 固相萃取柱，凈化過(guò)程可以節(jié)約更多時(shí)間，最終選擇Cleanert PEP Plus凈化柱進(jìn)行試驗(yàn)。

3 方法驗(yàn)證

3.1 基質(zhì)效應(yīng)的考察

在使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定樣品時(shí)，會(huì)存在基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）問(wèn)題。一般采用同一樣品的空白基質(zhì)配制系列濃度的曲線(xiàn)進(jìn)行校正定量，以抵消基質(zhì)效應(yīng)對(duì)方法的精密度和準(zhǔn)確度產(chǎn)生的干擾[22]。本方法選擇空白雞蛋、雞肉和蛋糕經(jīng)樣品前處理完，制備出空白基質(zhì)，用該空白基質(zhì)溶液和純?cè)噭┘状挤謩e配制一定梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用下列公式進(jìn)行判斷基質(zhì)效應(yīng)的影響。ME/%=k2/k1×100，當(dāng)ME＞100%時(shí)，表明基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME＜100%時(shí)，表明基質(zhì)抑制效應(yīng)，式中：k1 為純?cè)噭┡渲魄€(xiàn)的斜率，k2 為基質(zhì)溶液配制曲線(xiàn)的斜率。氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物在雞蛋、雞肉和蛋糕基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)表3。

表3 氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物在雞蛋、雞肉和蛋糕基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)Table 3 The matrix effect of fipronil and its metabolites in chicken egg，muscle and cake

通過(guò)表3可以看出，氟蟲(chóng)腈、氟甲腈和氟蟲(chóng)腈亞砜在3 種基質(zhì)中有基質(zhì)抑制效應(yīng)，氟蟲(chóng)腈砜在雞蛋、雞肉中有基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

3.2 方法的線(xiàn)性及靈敏度

選取雞蛋、雞肉和蛋糕空白樣品，分別添加1、2、5、10、20、50 μg/kg 梯度水平制作基質(zhì)曲線(xiàn)，3 種基質(zhì)的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)R2等參數(shù)見(jiàn)表4。

氟蟲(chóng)腈及代謝物曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系良好，R2均大于0.99，各化合物的定量離子的信噪比均大于10，將氟蟲(chóng)腈及代謝物的定量限均定為1 μg/kg，以3 倍信噪比確定為定性限，氟蟲(chóng)腈及代謝物的定性限為0.4 μg/kg。

表4 氟蟲(chóng)腈及代謝物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢出限、定量限數(shù)據(jù)Table 4 Linear equations and correlation coefficients，liner range，LOD，LOQ data of fipronil and metabolites

3.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

參考GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》附錄F 中檢測(cè)方法確認(rèn)的要求中相關(guān)內(nèi)容[23]，選取雞蛋、雞肉和蛋糕空白樣品，分別添加1（定量限）、2、5 μg/kg（限量值）3個(gè)水平，進(jìn)行方法準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)。每個(gè)濃度水平進(jìn)行6 平行試驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5，其結(jié)果符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的相關(guān)要求。

表5 方法的平均回收率和精密度（n=6）Table 5 Recovery and precision of the method（n=6）

3.4 實(shí)際樣品分析

從市場(chǎng)上抽取50 批次雞蛋和雞肉，20 批次蛋糕樣品進(jìn)行檢測(cè)，均未檢測(cè)出陽(yáng)性樣品。

4 結(jié)論

本研究建立了LC-MS/MS 法測(cè)定雞蛋、雞肉和蛋糕中氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物的測(cè)定方法。研究中優(yōu)化了提取條件，凈化條件和色譜質(zhì)譜條件，按優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，該方法的回收率、精密度、線(xiàn)性、測(cè)定低限等均滿(mǎn)足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求，適用于雞蛋、雞肉和蛋糕中氟蟲(chóng)腈及代謝物的快速檢測(cè)。