汪建紅

（1.內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川 內(nèi)江 641110；2.四川省高等學(xué)校果類廢棄物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江 641110）

荸薺是一種較為常見的香甜可口、美味多汁、營(yíng)養(yǎng)豐富的水果，我國(guó)的種植面積達(dá)到5 萬(wàn)hm2以上，年產(chǎn)鮮果百萬(wàn)t 以上，按照總荸薺質(zhì)量的26%計(jì)算荸薺果皮質(zhì)量，每年可產(chǎn)生26 萬(wàn)t 以上的荸薺皮[1-7]。這些荸薺皮往往得不到充分利用，造成巨大的浪費(fèi)。荸薺皮營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種功能成分，比如多糖、黃酮等[8-9]。多糖具有消炎、抗腫瘤等多種生物活性，提取荸薺皮中的多糖可使資源得到更充分的利用，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)價(jià)值最大化，也符合綠色環(huán)保的時(shí)代觀念[10]。

提取多糖的常見方法有熱水浸提法、超聲波法、微波法、酶法等。熱水浸提法[11]的提取效率較低，且提取物雜質(zhì)含量較多。超聲波法[12-15]和微波法[16-17]效率高，時(shí)間短，但都會(huì)對(duì)人體帶來(lái)負(fù)面影響，危害人體健康。酶法[18-19]提取效率較高，但操作步驟多，還需要后處理，且酶易失活，部分酶還會(huì)導(dǎo)致多糖分解。內(nèi)部沸騰法[20-21]是一種較新的提取方法，利用在細(xì)胞組織內(nèi)部的沸騰使多糖更容易解吸進(jìn)入溶液中，可快速高效的提取多糖，并且提取時(shí)間較短。因此本文采用內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮中多糖，并利用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型優(yōu)化提取工藝條件，以獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果，為荸薺皮多糖的開發(fā)利用提供基本參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

荸薺：四川內(nèi)江東興區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；葡萄糖、乙酸鈉、乙酸、無(wú)水乙醇（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T-6 型紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州英峪予華儀器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FA2204A 型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；SHA-B 恒溫水浴振蕩器：金壇市漢康電子有限公司；DFT-100 型手提式萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；SHB-B95 型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；CS101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：重慶試驗(yàn)設(shè)備廠。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

將荸薺取皮后洗凈，在鼓風(fēng)干燥箱中低溫烘干后，粉碎備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照文獻(xiàn)方法[18-19，22]，以烘干至恒重的葡萄糖為原料設(shè)計(jì)方案繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出在0.008 mg/mL～0.048 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程為A =33.4C-0.070 4，R2=0.999 4。

2.3 荸薺皮多糖的提取和測(cè)定

在圓底燒瓶中加入1.00 g 荸薺皮粉和5 mL80%的乙醇溶液，常溫下浸泡 30 min，然后按照 20∶1（mL/g）的液料比加入一定pH 值和溫度的水作溶劑，并保持在此溫度下水浴回流一定時(shí)間，冷卻，離心獲取上層清液，將該清液轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中，用水定容。

從此容量瓶中準(zhǔn)確移取1.00 mL 提取液，稀釋250倍，再準(zhǔn)確移取1.00 mL 稀釋液，利用6%的苯酚溶液和濃硫酸顯色，顯色后在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的稀釋液中多糖濃度，按照式（1）計(jì)算多糖得率。

2.4 單因素試驗(yàn)

在荸薺皮粉質(zhì)量為1.00 g，乙醇濃度80%，乙醇體積 5 mL，液料比 20∶1（mL/g）的條件下，考查 pH 值（3、4、5、6、7）、提取溫度（75、80、85、90、95 ℃）和提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）等單因素對(duì)多糖得率的影響。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以pH 值A(chǔ)、提取溫度B和提取時(shí)間C 為自變量，以多糖得率R 為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)響應(yīng)面模型，其中5個(gè)中心點(diǎn)試驗(yàn)，12個(gè)試因試驗(yàn)，并按照模型安排響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化試驗(yàn)條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 pH 值對(duì)荸薺皮多糖得率的影響

pH 值對(duì)荸薺皮多糖得率的影響如圖1所示。

圖1 pH值的影響Fig.1 Influence of pH

從圖1可看到，在3～7 范圍內(nèi)，隨著pH 值的增大，多糖得率先增加后下降，在pH=5 時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)。這是因?yàn)橐欢╬H 值時(shí)，荸薺皮組織會(huì)變得較為脆弱，內(nèi)部沸騰對(duì)荸薺皮的作用效果更好，有利于多糖解吸進(jìn)入溶液中[23-24]。因此選擇最佳pH 值為5。

3.1.2 提取溫度對(duì)荸薺皮多糖得率的影響

提取溫度對(duì)荸薺皮多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 溫度的影響Fig.2 Influecne of temperature

從圖2可看到，隨溫度的增加，多糖得率先逐漸增加，然后逐漸降低，當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)，得率達(dá)到峰值。這是因?yàn)?，溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)越活躍，內(nèi)部沸騰越劇烈，越有利于多糖解吸后擴(kuò)散到溶液中；但溫度過(guò)高時(shí)，對(duì)流擴(kuò)散維持時(shí)間會(huì)縮短，由于多糖分子較大，擴(kuò)散遷移較慢，會(huì)導(dǎo)致大量多糖在擴(kuò)散出之前就已經(jīng)造成了溶出通道的堵塞[23-24]。因此，選擇最佳提取溫度為80 ℃。

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)荸薺皮多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)荸薺皮多糖提取效果的影響如圖3所示。

圖3 時(shí)間的影響Fig.3 Influence of time

從圖3可知，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率呈先逐漸增大后逐漸降低的趨勢(shì)，且拐點(diǎn)出現(xiàn)在30 min 時(shí)。這是由于時(shí)間越長(zhǎng)，就會(huì)有越多的多糖在內(nèi)部沸騰作用下擴(kuò)散到提取溶液中；但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，內(nèi)部沸騰已接近于停止，擴(kuò)散通道已近乎于堵塞，導(dǎo)致更多的多糖難以浸出，已經(jīng)浸出的多糖也可能部分分解變質(zhì)[23-24]。因此選擇最佳提取時(shí)間為30 min。

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析及結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以pH 值A(chǔ)、提取溫度B和提取時(shí)間C 為自變量，以多糖得率R 為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)的響應(yīng)面模型因素水平編碼如表1所示，試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

表2 關(guān)于多糖得率的響應(yīng)面試驗(yàn)方案及其結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement on yield of polysaccharide and the results

3.2.2 方差分析

利用Design Expert 8.05b 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出荸薺皮多糖得率對(duì)pH 值、提取溫度和提取時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程為：

R=19.3-0.017A+0.42B-0.81C-0.065AB+0.57AC+1.04BC-1.88A2-0.76B2-0.56C2

方差分析見表3，可信度分析見表4。

從表3可看到該模型的P＜0.001，極顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，說(shuō)明該模型的方差均由隨機(jī)誤差引起。從表4可知該模型的R2=0.991 1，R2Adj=0.979 6，說(shuō)明該模型擬合情況良好，回歸效果也較好，可以解釋99.11%響應(yīng)值變化，未控制因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小（0.89 %）；且 CV=1.15 %，信噪比為 24.914，說(shuō)明試驗(yàn)誤差小，說(shuō)明用此模型對(duì)多糖得率進(jìn)行預(yù)測(cè)是可行的。

從表3還可看到一次項(xiàng)中B（溫度）、C（時(shí)間）對(duì)多糖得率的影響極顯著（P＜0.001），A（pH 值）的影響不顯著；二次項(xiàng)中 AC、BC、A2、B2和 C2的影響極顯著，AB的影響不顯著。根據(jù)表中F 值的大小可知各因素影響先后次序?yàn)椋篊＞B＞A。

3.2.3 響應(yīng)面圖和等高線分析

各因素間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線如圖4～圖6所示。

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

表4 回歸方程可信度分析Table 4 Creditability analysis of regression equations

圖4 溫度、pH 值對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Influence of temperature and pH on yield of polysaccharide

圖5 時(shí)間、溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Influence of time and temperature on yield of polysaccharide

從圖4～圖6還可看到pH 值、溫度和時(shí)間之間存在交互效應(yīng)，對(duì)多糖得率影響不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系，從曲線上表現(xiàn)出來(lái)：時(shí)間影響使曲線更陡峭，溫度次之，pH 值最平緩，該結(jié)論與方差分析表中的結(jié)果一致。

3.2.4 最佳試驗(yàn)條件的獲得和驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 8.05b 軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果的優(yōu)化分析，得出荸薺皮多糖提取的提取工藝優(yōu)化條件為：pH4.85，溫度 78 ℃，時(shí)間 20 min，在該條件下多糖得率理論上可達(dá)19.72%，但考慮到操作的方便，將最佳工藝條件修正為pH 5，溫度80 ℃，時(shí)間20 min，此時(shí)理論預(yù)測(cè)值為19.55%。在此條件下作5 次平行試驗(yàn)，得到荸薺皮多糖的平均得率為20.07%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為 3.45 %，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.66%。此結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明了此模型的可靠性。

圖6 pH值、時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.6 Influence of pH and time on yield of polysaccharide

4 結(jié)論

將常作為垃圾被拋棄的荸薺皮作為提取多糖的原料，既提高了荸薺的利用價(jià)值，還可減少荸薺皮對(duì)環(huán)境的污染。本試驗(yàn)建立了利用內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮中多糖的工藝方法，并利用響應(yīng)面模型對(duì)內(nèi)部沸騰法提取荸薺皮多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出其最佳條件為：pH 4.85，溫度 78 ℃，時(shí)間 20 min，考慮到操作方便性，將條件修正為：pH 5，溫度 80 ℃，時(shí)間 20 min，此條件下驗(yàn)證試驗(yàn)的平均得率為20.07%（RSD=3.45%），與該條件下理論預(yù)測(cè)值19.55%的相對(duì)誤差為2.66%。該方法獲得的多糖得率比相同條件下熱水浸提法時(shí)的多糖得率17.57%高14.23%，說(shuō)明了內(nèi)部沸騰法的優(yōu)點(diǎn)，是一種值得研究的方法。該結(jié)論為荸薺皮多糖的開發(fā)利用提供了一定的參考依據(jù)。