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        柑橘皮黃酮石灰水提取工藝及果膠去除效果的研究

        2019-05-09 09:12:14李繼偉任璇周紹慶李媛劉夢蝶焦雄
        食品研究與開發(fā) 2019年10期
        關鍵詞:石灰水水浴液料

        李繼偉,任璇,周紹慶,李媛,劉夢蝶,焦雄

        (武漢設計工程學院食品與生物科技學院,湖北 武漢 430205)

        柑橘皮渣是柑橘加工的副產(chǎn)物,我國每年產(chǎn)生的柑橘皮渣均在500 萬噸以上[1]。柑橘皮渣中含有黃酮、果膠等多種生物活性物質。黃酮類化合物具有降低血糖血脂[2-4]、調(diào)節(jié)腸道微生物[5]、調(diào)節(jié)消化酶活性[2-3,6-7]、促進消化[8]、抗氧化[9]等多種生理功能,有很高的食用、藥用價值[10]。

        溶劑提取法是黃酮提取最常用的方法,乙醇是黃酮提取最常用的溶劑,但其成本較高。堿法提取黃酮是一種廉價、有效的方法。本課題組前期選用氫氧化鈉水溶液進行柑橘皮黃酮的提取,但可溶性果膠也會一起被提取出來,造成黃酮提取液易凝膠化,給后續(xù)純化帶來困難。所以,怎樣經(jīng)濟高效地提取黃酮,同時又方便黃酮的后續(xù)純化,是柑橘皮黃酮利用中亟待解決的問題。

        柑橘皮渣中存在大量果膠,可溶性果膠能與Ca2+形成“蛋箱型”結構而降低其溶解度,所以在提取過程中使用鈣鹽可降低雜質果膠的含量。本試驗選用石灰水為提取劑,通過單因素和正交試驗來優(yōu)化柑橘皮黃酮的提取條件。同時,對石灰水提取法、NaOH 提取法和乙醇提取法3 種方法的黃酮得率及所得黃酮提取液中的果膠含量進行比較,以期為柑橘皮黃酮的提取及開發(fā)利用提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        柑橘皮:60 ℃烘干,粉碎,過40 目篩,干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

        蘆丁標準品(純度≥98%)、無水乙醇(分析純)、α-萘酚(分析純)、咔唑(純度≥97 %)、濃硫酸(優(yōu)級純):國藥集團化學試劑有限公司;半乳糖醛酸(純度≥97%):上海金穗生物科技有限公司。

        SHZ-88 型水浴恒溫振蕩箱:金壇市醫(yī)療儀器廠;TDL-5-A 型高速離心機:上海安亭科學儀器廠;722 型可見光分光光度計:天津市普瑞斯儀器有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 石灰水法提取黃酮流程

        取柑橘皮0.5 g,加入一定稀釋度的飽和石灰水,放入恒溫水浴振蕩箱中以120 r/min 振蕩提取,5 000 r/min離心10 min,取上清,即為黃酮粗提液。

        1.2.2 黃酮得率的測定方法

        蘆丁標準曲線的繪制參照李繼偉等[11]的方法,以蘆丁含量x(mg)為橫坐標,以吸光值y(OD510)為縱坐標,繪制標準曲線,所得回歸方程為:y=1.169 1x+0.001 4,R2=0.999 9。樣品中黃酮含量的測定依照標準曲線,柑橘皮黃酮得率 P(mg/g)=cV/M

        式中:c 為提取液黃酮含量,mg/mL;V 為提取液體積,mL;M 為柑橘皮粉末質量,g。

        1.2.3 石灰水法提取黃酮的單因素及正交試驗方法

        選取飽和石灰水稀釋倍數(shù)(原液、2、4、8、16、32倍)、水浴時間(0、0.5、1、2、4、6 h)、水浴溫度(20、40、60、70、80、90 ℃)和液料比(10、20、30、40、60、80 mL/g)共4個因素進行單因素試驗,每組試驗至少重復兩次,結果取平均值。根據(jù)單因素試驗結果,進行三因素三水平正交試驗,獲得柑橘皮黃酮提取的最優(yōu)條件,并進行驗證。

        1.2.4 不同黃酮提取方法的比較

        1.2.4.1 不同提取方法對柑橘皮黃酮得率的影響

        分別以石灰水、乙醇和NaOH 為提取劑,提取柑橘皮中的黃酮,并對黃酮含量進行比較。每種提取方法的最佳條件均為本實驗室前期優(yōu)化所得。其中,石灰水法的提取條件為:飽和石灰水稀釋4 倍,液料比30 mL/g,90 ℃水浴時間2 h;乙醇法的提取條件為:乙醇濃度 60%,液料比 30 mL/g,70 ℃水浴 2 h;NaOH 法的提取條件為:NaOH pH 12,液料比30 mL/g,90 ℃水浴3 h。

        1.2.4.2 不同提取方法對黃酮提取液中果膠含量的影響

        1)半乳糖醛酸標準曲線的繪制

        半乳糖醛酸標準曲線的繪制參照尚雪波等[12],并稍有改動,具體步驟如下:精密稱取半乳糖醛酸5 mg,蒸餾水定容至50 mL,即得100 μg/mL 的標準溶液。精密量取上述標準溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 分別置于試管中,加入蒸餾水定容至1 mL,加入0.1 %咔唑-乙醇溶液0.25 mL,加入濃硫酸5 mL,85 ℃水浴20 min,以第一管為空白對照,用分光光度計在525 nm處測吸光值,以半乳糖醛酸含量x(μg)為橫坐標,以吸光值y(OD525)為縱坐標繪制標準曲線,所得回歸方程為:y=0.013 9x-0.004,R2=0.999 5。

        2)柑橘皮中總果膠測定方法

        柑橘皮果膠含量的測定參照丁建東等[13],并稍有改動,具體方法如下:稱取1 g 柑橘皮,加入75%乙醇溶液 35 mL,80 ℃水浴 10 min,5 000 r/min 離心 10 min,棄去上清液。重復上述步驟,直到上清液不再產(chǎn)生molish 反應。用蒸餾水將沉淀洗入100 mL 容量瓶中,加入1 mol/L 的氫氧化鈉溶液5 mL,用蒸餾水定容至100 mL,80 ℃水浴振蕩 15 min,然后 5 000 r/min 離心10 min。取上清,參照標準曲線方法測定果膠含量,即為可溶性果膠含量。果膠含量P/%=(cV×103/M)×100

        式中:c 為溶液中果膠濃度,mg/mL;V 為溶液體積,mL;M 為樣品質量,g。

        收集上述步驟所得沉淀,加入1 mol/L 硫酸溶液25 mL,沸水浴 1 h,冷水浴快速冷卻,5 000 r/min 離心10 min,取上清液,用蒸餾水定容至200 mL,參照標準曲線方法測定果膠含量。不溶性果膠含量計算同可溶性果膠。重復本步驟兩次,將3 次所得果膠含量相加,即為不溶性果膠含量。

        總果膠含量(%)=可溶性果膠含量(%)+不可溶果膠含量(%)。

        3)不同方法提取的果膠比率的測定方法

        由于提取液中含有還原糖等干擾成分,所以采用差減法測定不同方法提取的果膠比率,即提取的果膠比率(%)=柑橘皮中總果膠含量(%)-殘渣中果膠占原粉末的比率(%)。參照上述方法,測定1.2.4.1 中不同提取方法所得殘渣中果膠的量,計算并比較各提取方法提取的果膠比率。

        2 結果與分析

        2.1 單因素試驗結果與分析

        2.1.1 飽和石灰水稀釋度對黃酮得率的影響

        飽和石灰水稀釋倍數(shù)對黃酮得率的影響見圖1。

        圖1 石灰水濃度對黃酮得率的影響Fig.1 The effect of lime water concentration on the extraction rate of flavonoids

        黃酮得率隨飽和石灰水稀釋度的增加先上升后下降,當稀釋倍數(shù)為8 倍時,黃酮得率最高為5.16 mg/g。這可能是因為低濃度的石灰水不利于黃酮提取,而高濃度的石灰水pH 值過高(試驗測得飽和石灰水的pH值為13.56)對黃酮有一定的破壞作用。所以飽和石灰水的稀釋倍數(shù)8 倍為最佳。

        2.1.2 水浴時間對黃酮得率的影響

        水浴時間對黃酮得率的影響見圖2。

        圖2 水浴時間對黃酮得率的影響Fig.2 The effect of water bath time on the extraction rate of flavonoids

        黃酮得率隨水浴時間的延長呈現(xiàn)先快速增加后逐漸平穩(wěn)的趨勢,水浴時間從0 h 增加到2 h 時,黃酮得率從3.64 mg/g 提升到5.09 mg/g,水浴時間繼續(xù)延長至6 h 時,黃酮得率為5.2 mg/g,增加緩慢,考慮到時間成本,故選擇最優(yōu)水浴時間為2 h。

        2.1.3 水浴溫度對黃酮得率的影響

        水浴溫度對黃酮得率的影響見圖3。

        圖3 水浴溫度對黃酮得率的影響Fig.3 The effect of water bath temperature on the extraction rate of flavonoids

        隨著水浴溫度的升高,黃酮得率先增加然后趨于平穩(wěn);水浴溫度從20 ℃上升至80 ℃時,黃酮得率從3.95 mg/g 增加到最高5.05 mg/g,當水浴溫度升高至90 ℃時,黃酮得率基本保持不變。故選擇80 ℃為水浴最優(yōu)溫度。

        2.1.4 液料比對黃酮得率的影響

        液料比對黃酮得率的影響見圖4。

        圖4 液料比對黃酮得率的影響Fig.4 The effect of liquid-powder ratio on the extraction rate of flavonoids

        黃酮得率隨液料比的增加而增加,當液料比為10 mL/g 時,黃酮得率為4.35 mg/g,液料比增加到30 mL/g 時,黃酮得率達到最大,為5.06 mg/g,隨著液料比的再增加,黃酮得率基本維持不變。故選擇液料比30 mL/g 為最優(yōu)條件。

        2.2 正交及驗證性試驗結果及分析

        選取飽和石灰水稀釋度、水浴時間、水浴溫度進行三因素三水平的正交試驗,其余因素為單因素最佳水平,結果見表1。

        表1 正交水平試驗結果表Table 1 Table of orthogonal experimental results

        各因素對黃酮得率的影響依次為:水浴時間>飽和石灰水的稀釋倍數(shù)>水浴溫度,提取的最優(yōu)條件組合為A1B2C3,對優(yōu)組合進行驗證,黃酮的得率為(5.15±0.03)mg/g,表明正交試驗所得結果可靠,即最佳提取條件為:飽和石灰水稀釋4 倍、水浴時間2 h、水浴溫度90 ℃。

        2.3 不同黃酮提取方法比較的結果

        不同黃酮提取方法的比較結果見表2。

        表2 不同提取方法的比較Table 2 Comparison of different extraction methods

        分別以石灰水、乙醇和NaOH 為提取劑,其中石灰水法黃酮得率為5.15 mg/g,與NaOH 提取法黃酮得率的5.26 mg/g 相差不大,但都大于乙醇提取法的黃酮得率,所以石灰水和NaOH 都可以較好的提取柑橘皮中的黃酮。

        試驗測定,柑橘皮中,可溶性果膠的含量為4.68%,不可溶性果膠的含量為10.68%,總果膠含量為15.36%。其中,乙醇法提取的果膠比率最低,為0.82%;石灰水法提取的果膠比率次之,為1.7%;NaOH 法提取的果膠比率最高,為4.67%,且石灰水提取法和乙醇提取法提取的果膠都遠低于NaOH 提取法,有利于黃酮類化合物的后期純化。

        3 結論

        石灰水提取柑橘皮黃酮的最佳條件為:飽和石灰水稀釋倍數(shù)為4 倍、液料比為30 mL/g、90 ℃水浴2 h,最大黃酮得率為(5.15±0.03)mg/g。試驗測得柑橘皮中果膠的含量為15.36%,與文獻相符[12]。不同提取方法比較發(fā)現(xiàn),NaOH 法黃酮得率與石灰水法相近,但均高于乙醇法。石灰水法黃酮得率與NaOH 法接近,提取的果膠雜質卻大幅降低,由4.67%降至1.7%,降低了63.6%,所以結合后期純化綜合考慮,石灰水法優(yōu)于NaOH 提取法,而乙醇提取法雖然雜質果膠含量低,但黃酮得率也較低,而且溶劑成本較高,也會溶解更多脂溶性雜質(如柑橘精油等)。所以石灰水提取法既能有效的提取柑橘皮中的黃酮,又有利于黃酮的后期純化。

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