張瑞雪，崔欣悅，馬勇，劉金虎，張子韜，谷瑞增，魏穎，*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京 100015；3.寧夏光彩生物科技有限公司，寧夏 銀川 750004）

枸杞（Lycium chinense Mill）為茄科枸杞屬（Lycium Linn.）植物，其果實是一種“藥食同源”的功能保健性食品，也是一味常用的補肝益腎中藥，其色鮮紅，味酸甜[1]。枸杞在地球上約80 多種，在我國有7個種3個變種，主要分布于我國北部地區(qū)[2]，尤其寧夏枸杞在我國寧夏地區(qū)已形成大規(guī)模種植。

現(xiàn)代科學研究發(fā)現(xiàn)枸杞中化學成分類型多樣[3]，主要涉及生物堿類、黃酮類、萜類等化合物，此外，多糖及類胡蘿卜素衍生物也是枸杞中常見的成分?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)枸杞具有多種活性，包括抗氧化、抗腫瘤、抗炎、肝保護、神經(jīng)保護、抗微生物及輻射保護活性等。近年來，隨著人們對養(yǎng)生保健的重視，枸杞加工的研究越來越深入。傳統(tǒng)枸杞產(chǎn)品，如枸杞汁、枸杞醋和枸杞酒的工藝逐漸改進；枸杞多糖、黃酮和籽油提取產(chǎn)品，枸杞干制品和枸杞復合產(chǎn)品開發(fā)已成為枸杞加工業(yè)研究的熱點。

枸杞是著名的防衰老滋補品[4]，被列為首選的延緩衰老食品之一[5]，許多養(yǎng)生方劑中都有枸杞。目前，枸杞功能活性方面，較側(cè)重于提取物和多糖，對枸杞全果的利用研究鮮有報道。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是存在于人類和動物體內(nèi)的天然有益腸道菌群，果蔬經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，能夠延長果蔬的保質(zhì)期，改善新鮮蔬菜的感官特性，并且產(chǎn)生多種功能性物質(zhì)[6-7]，如超氧化物歧化酶、還原性谷胱甘肽、阿魏酸等，提升其營養(yǎng)價值和功能活性。本文選用經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的枸杞全果發(fā)酵液，以細胞模型為基礎，研究其抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)活性，為枸杞的功能評價、合理開發(fā)利用奠定實驗基礎并提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞發(fā)酵液原液（1 號～3 號）：寧夏光彩生物科技有限公司（1 號）、臺灣大漢酵素有限公司（2 號）、日本萬田酵素有限公司（3 號）；小鼠（Balb/c，6 周齡～8 周齡）：北京維通利華實驗動物技術有限公司；偶氮二異丁脒鹽酸鹽[2，2'-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、2’，7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（2’，7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）：sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基：Hyclon 公司；胎牛血清：杭州四季青公司；胰蛋白酶和中性紅：Amresco 公司；臺盼藍、紅細胞裂解液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、NO 試劑盒、CCK-8 試劑盒：碧云天生物技術研究所；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：現(xiàn)用現(xiàn)配，裝瓶滅菌后待用。

1.2 儀器與設備

Spectra MR 多功能酶標儀：美國dynex；AC2-6S1生物安全柜：新加坡藝思高科技有限公司；HF90 CO2培養(yǎng)箱：上海力申科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞發(fā)酵液清除自由基的影響

1.3.1.1 樣品處理

樣品處理前，單細胞懸液以1.0×105個/mL 接于6孔板，每孔2 mL 細胞懸液。待24 h 后細胞單層貼壁，樣品溶于熒光染料處理細胞（2 mL/孔），同時設空白對照組和AAPH 組，每組設置6個平行樣本。培養(yǎng)箱37 ℃繼續(xù)孵育1 h 后，吸棄含有樣品的培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液清洗細胞兩次，除空白對照組外，每孔加入800 μmol/L AAPH，繼續(xù)培養(yǎng) 30 min，MTT 法測定OD 值，計算細胞相對存活率。

1.3.1.2 活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）測定

以1.0×105個/mL 細胞密度接種 96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔 2 mL，放置 37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后小心吸走6 孔中的細胞上清液，用PBS 清洗一次。加入無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基稀釋的枸杞發(fā)酵液和熒光染料DCFH-DA，終濃度為25 μmol/L 2 mL，于 37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 30 min，然后取出吸走上清液，用PBS 小心清洗3 次。最后加入抗氧損傷劑AAPH，置于流式細胞儀測定相對熒光值。細胞內(nèi)抗氧化能力以ROS 相對產(chǎn)生率來表示。

1.3.2 枸杞發(fā)酵液對T/B 淋巴細胞增殖的影響

1.3.2.1 小鼠脾細胞懸液的制備

將小鼠（Balb/c）拉頸處死，于75 %乙醇中浸泡5 min 進行消毒處理，無菌分離完整脾臟，用PBS 沖去浮血，剝除結(jié)締組織及脂肪成分。注射器吸取約5 mL PBS，輕輕插入脾內(nèi)吹出細胞，重復操作數(shù)次至脾外膜透明，剩余脾組織剪成大小1 mm3小塊，剪碎后置于小燒杯上的200 目不銹鋼濾網(wǎng)上，用注射器針芯研磨，PBS 液洗滌，收集沖洗液至離心管，1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，加入3 mL 紅細胞裂解液，靜置2 min，加入 10 mL PBS 終止反應，離心（1 200 r/min，5 min）棄上清，用 PBS 液洗兩次，離心（1 200 r/min，5 min），用RPMI-1640 不完全培養(yǎng)基洗一次，離心（1 200 r/min，5 min），棄上清。加適量RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素和10 mmol/L Hepes）。調(diào)整細胞濃度至 2×106個細胞/mL，臺盼蘭染色檢測細胞存活率大于95%。

1.3.2.2 枸杞發(fā)酵液對脾淋巴細胞增殖的影響

將脾細胞懸液（2×106個細胞/mL）按 100 μL/孔加入到96 孔培養(yǎng)板中，再添加10 μL ConA/LPS（終濃度為 5 μg/mL）和不添加 ConA，10 μL 樣品溶液，設置對照組、模型組和樣品組，每組做6 次重復，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

選用CCK-8 試劑盒反應樣品對脾細胞和淋巴細胞增殖能力，在490 nm 測定吸光值，結(jié)果分別用增殖率和刺激指數(shù)（SI）表示，計算如下：

1.3.3 枸杞發(fā)酵液對小鼠腹腔巨噬細胞的影響

1.3.3.1 小鼠腹腔巨噬細胞的制備

Balb/c 小鼠，于實驗前3 d 腹腔注射1.5 mL4%肉湯淀粉溶液。拉頸處死小鼠，于無菌工作臺上將其腹部皮膚剝離，用一次性注射器向腹腔內(nèi)注入RPMI-1640 不完全培養(yǎng)液 4 mL，輕柔腹部 2 min～3 min，用一次性注射器取其腹部液體，反復2 次～3 次。1 200 r/min離心8 min 收集細胞，洗滌2 次，在倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)，用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度達1×106個/mL，加入96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，將細胞培養(yǎng)板放入37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h，吸棄上清，用預溫培養(yǎng)基洗去未貼壁細胞，再加入含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，制備96 孔板巨噬細胞單層。

1.3.3.2 枸杞發(fā)酵液對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性的測定

模型組每孔加入 10 μLLPS（濃度 30 μg/mL），實驗組加入LPS 與不同濃度的枸杞發(fā)酵液各10 μL/孔，每組各設6個復孔，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

培養(yǎng)24 h 后，用預溫的無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，每孔加入200 μL 預溫的0.1 %中性紅溶液，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h；傾去上清液，用預溫RPMI-1640 培養(yǎng)液清洗3 遍，洗去未被吞噬的中性紅；每孔加入200 μL 細胞溶解液（乙酸∶50%乙醇=1∶100，體積比），25 ℃下放置 2 h ～3 h，待細胞溶解后，用酶標儀測定OD550值。吞噬指數(shù)（pinocytosis index，PI）計算如下：

1.3.3.3 枸杞發(fā)酵液對巨噬細胞NO 生成量的影響

小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)樣品24 h 干預后，收集上清液，依據(jù)NO 試劑盒說明書測定NO 生成量。

1.3.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，實驗結(jié)果以均值±標準偏差（Mean±SD）表示，并采用組間t 檢驗，P ＜ 0.05 具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

細胞內(nèi)短時間ROS 水平的波動對于調(diào)節(jié)細胞功能具有重要的作用，但是如果細胞暴露在高劑量的或是持續(xù)性的ROS 中的時候，ROS 防御體系的能力不足以去應對機體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，此時ROS 動態(tài)平衡狀態(tài)被打破，即會導致氧化應激狀態(tài)的形成。大量存在的非生理水平的ROS 除了擾亂細胞正常的信號通路外，還會和多種細胞結(jié)構(gòu)成份包括DNA、蛋白質(zhì)、脂類在內(nèi)的生物大分子發(fā)生反應，對機體產(chǎn)生一系列損害以致引發(fā)疾病[8]。

枸杞發(fā)酵汁處理HepG2 細胞后ROS 的測定結(jié)果見圖1。

圖1 枸杞發(fā)酵液緩解HepG2氧化應激的作用Fig.1 The oxidative stress effect of Lycium chinense Mill fermentation liquid on HepG2 cells

由圖1可知，在稀釋倍數(shù)為102時，1 號枸杞發(fā)酵液顯著（P＜0.01）提升細胞對抗氧化應激狀態(tài)的能力，ROS 相對產(chǎn)生率最低，為0.61，同時ROS 相對產(chǎn)生率與稀釋倍數(shù)呈U-型量效關系。2 號枸杞發(fā)酵液作用HepG2 細胞時，其降低細胞氧化應激狀態(tài)的能力減弱。由圖1可知，3 號枸杞發(fā)酵液作用效果優(yōu)于2 號，在稀釋倍數(shù)為102，ROS 相對產(chǎn)生率為0.67，具有極顯著（P＜0.01）抗氧化能力，但作用能力比1 號枸杞發(fā)酵液弱。

圖2為小鼠脾細胞在不同濃度枸杞發(fā)酵液干預72 h 后，細胞增殖情況。

圖2 枸杞發(fā)酵液對小鼠脾細胞增殖的影響Fig.2 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on the proliferation of mice splenocytes

從圖2可以看出，枸杞發(fā)酵液7個作用濃度均可明顯刺激小鼠脾細胞增殖，對靜止的淋巴細胞具有明顯的促進作用，存在一定的絲裂原作用。在稀釋倍數(shù)為 102時，1 號枸杞發(fā)酵液顯著（P＜0.01）促進脾細胞增殖，增殖率最大，為 1.58，明顯高于 2 號（1.38）和 3 號枸杞發(fā)酵液（1.37），同時脾細胞增殖能力與作用濃度呈倒U-型量效關系。

脾細胞在有絲分裂原如ConA、LPS 等的刺激下，其形態(tài)和代謝會發(fā)生一系列的改變，轉(zhuǎn)化為母細胞并分化增殖。其中ConA 刺激T 細胞增殖，LPS 刺激B 細胞增殖。因此根據(jù)非特異性促有絲分裂原激活T 和B細胞增殖反應的程度，可推測T 和B 細胞識別特異性抗原增殖反應。圖3和圖4分別為T 淋巴細胞和B 淋巴細胞在不同濃度枸杞發(fā)酵液干預72 h 后細胞增殖情況。

圖3 枸杞發(fā)酵液對Con A誘導的T淋巴細胞增殖的影響Fig.3 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on the proliferation of T lymphocytes induced by Con A

圖4 枸杞發(fā)酵液對LPS誘導的B淋巴細胞增殖的影響Fig.4 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on the proliferation of B lymphocytes induced by LPS

由圖3得出：與模型組相比，在稀釋倍數(shù)為2、10和102濃度作用下，1 號枸杞發(fā)酵液對ConA 誘導的T淋巴細胞增殖具有顯著（P＜0.01）促進作用，在稀釋倍數(shù)為102濃度時，SI 值高達1.3，而2 號枸杞發(fā)酵液只在稀釋倍數(shù)為102濃度時有明顯（P＜0.01）促進作用。3號枸杞發(fā)酵液在稀釋倍數(shù)較大時有促進T 淋巴細胞增值的作用。

由圖4得出：3 種枸杞發(fā)酵液對促進LPS 誘導的B 淋巴細胞增殖作用效果不明顯，在稀釋倍數(shù)為10、102和 103濃度作用下，1 號發(fā)酵液具有明顯（P＜0.01）促進增殖作用，其他兩種發(fā)酵液在所有濃度下幾乎沒有顯著促進B 淋巴細胞增殖作用。

巨噬細胞攝入大分子和顆粒狀或細胞狀物質(zhì)時主要通過胞吞作用來完成。胞吞作用即指細胞膜接觸大分子或顆粒狀物質(zhì)后，即將其包圍形成小泡并吞入細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程。選用吞噬中性紅能力來評價枸杞發(fā)酵液對巨噬細胞的吞噬能力的影響。枸杞發(fā)酵液對LPS 誘導的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響見圖5。

圖5 枸杞發(fā)酵液對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響Fig.5 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on neutral red pinocytosis by LPS-stimulated mice peritoneal macrophages

在LPS 的刺激下，1 號枸杞發(fā)酵液稀釋倍數(shù)為102時，對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力具有顯著（P＜0.01）促進作用，可以促進巨噬細胞吞入較大的固體或分子復合物，同時吞噬能力和濃度呈倒-U 型量效關系。2 號枸杞發(fā)酵液稀釋倍數(shù)為10 時、3 號枸杞發(fā)酵液在稀釋倍數(shù)為103時對巨噬細胞吞噬中性紅能力具有顯著（P＜0.01）促進作用。

激活的巨噬細胞利用L-精氨酸合成NO，增加巨噬細胞的細胞毒性，發(fā)揮非特異性殺菌和殺傷腫瘤細胞的作用，以及通過多條途徑引起免疫聯(lián)鎖反應[9]。因此，NO 合成是巨噬細胞被激活的重要標志，可以使巨噬細胞發(fā)揮非特異性免疫作用，并參與炎癥反應和免疫反應[10]。枸杞發(fā)酵液對小鼠腹腔巨噬細胞NO 生成的影響如圖6，在7個作用濃度下枸杞發(fā)酵液均可以促進小鼠腹腔巨噬細胞NO 生成。1 號枸杞發(fā)酵液在稀釋倍數(shù)為103濃度時，NO2-生成濃度最大，促進NO的生成最明顯，同時NO 生成量和作用濃度呈倒-U 型量效關系。2 號和3 號枸杞發(fā)酵液均能促進NO 的生成。

圖6 枸杞發(fā)酵液對體外小鼠腹腔巨噬細胞NO生成量的影響Fig.6 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on in vitro NO production by mice peritoneal macrophages

3 結(jié)論與討論

當機體存在大量的非生理水平的ROS 時，除了擾亂細胞正常的信號通路外，還會和多種細胞結(jié)構(gòu)成份包括脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、蛋白質(zhì)、脂類在內(nèi)的生物大分子發(fā)生反應，對機體產(chǎn)生一系列損害以致引發(fā)疾病。氧化應激與多種疾病中包括動脈粥樣硬化、糖尿病、肺纖維化、肝硬化、神經(jīng)退行性疾病和關節(jié)炎有著密切的關系，是衰老的主要原因[8]。同時，抗氧化劑可以使免疫系統(tǒng)保持活力，維持人體的穩(wěn)定狀態(tài)。

本研究表明：枸杞發(fā)酵液具有較好的清除細胞內(nèi)ROS 水平的能力、促進脾淋巴細胞增殖和提高LPS 誘導的腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力，這3 種不同來源的枸杞發(fā)酵液在稀釋倍數(shù)為10、102和103濃度時作用明顯，1 號產(chǎn)品的稀釋倍數(shù)為102濃度為后續(xù)相關試驗研究具有借鑒意義。枸杞發(fā)酵液具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)能力這可能與其含有豐富的有機酸、維生素和礦物質(zhì)有關。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，枸杞發(fā)酵液中含有23.07 g/L的有機酸，主要是乳酸、酒石酸和草酸等。枸杞中具有免疫調(diào)節(jié)的多糖類物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵后分解為小分子糖類，更易于人體吸收利用，發(fā)揮功效作用。豐富的維生素、礦物質(zhì)、黃酮類，有機酸和糖醇類物質(zhì)協(xié)同發(fā)揮抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，作用機理、量效關系和物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定需要進一步的研究。