郭 娜，姚子昂，于國(guó)友，吳海歌*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.威?？挡柹镝t(yī)藥有限公司，山東 威海 264200）

海參是高蛋白、低脂肪、低膽固醇的滋補(bǔ)品[1]，不僅富含蛋白質(zhì)、人體必需氨基酸以及各種微量元素、維生素等，而且含有許多生物活性物質(zhì)（如海參多糖、海藻皂苷、膠原蛋白、海參肽以及腦苷酯等），具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2-3]。但隨著我國(guó)海參養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，海參疾病的不斷爆發(fā)，成為制約海參養(yǎng)殖的瓶頸問(wèn)題[4]。在海參的消化道和體壁之間具有空腔，其中充滿液體和懸浮的類(lèi)似于人體血細(xì)胞的體細(xì)胞，海參的細(xì)胞免疫均由體細(xì)胞完成，體液免疫應(yīng)答基于體腔細(xì)胞分泌的各種免疫因子進(jìn)入體腔[5]。

我國(guó)沿海具有豐富的海藻資源，其中海帶含有豐富的褐藻膠、甘露醇、蛋白質(zhì)、碘、鈉、鉀、鈣、鎂和多種維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[6]，因其具有易獲得、成本低、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)成為海參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中理想的天然飼料，但海帶因其所含多糖組分達(dá)50%，在飼喂海參過(guò)程中往往會(huì)使養(yǎng)殖水體發(fā)粘，使養(yǎng)殖水易滋生細(xì)菌，從而誘發(fā)海參病變[6]。目前國(guó)內(nèi)外常用的海帶多糖降解的方法分為化學(xué)降解法，物理降解法和生物降解法[7-8]。其中生物降解法即酶解是用專(zhuān)一性糖苷酶或非專(zhuān)一性酶通過(guò)特異性開(kāi)裂多糖中的某一糖苷鍵，對(duì)多糖進(jìn)行酶解。較之化學(xué)法及物理法具有條件溫和，降解產(chǎn)物分子量易于控制、效率高、污染小等優(yōu)點(diǎn)[9]，是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室菌株假單胞菌（Pseudoalteromonas）H0-5的粗酶液對(duì)海帶進(jìn)行酶解，將海帶中多糖降解為3～5種聚合度不同的寡糖。使用具有抑菌活性并能調(diào)節(jié)海參免疫作用的海帶寡糖和酶解海帶泥飼喂海參，這樣不僅保留了海帶原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更消除了因未被海參消化的海帶多糖造成的水體黏稠繼而滋生病原微生物等的負(fù)面影響，既能抑制水體微生物的生長(zhǎng)，也能調(diào)節(jié)海參免疫功能，從而提高海參的抗病能力，達(dá)到海參綠色健康養(yǎng)殖預(yù)防海參病害發(fā)生的目的[10-13]。因此，海帶酶解產(chǎn)物在海參健康養(yǎng)殖中具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值及意義。

本研究混合不同比例海帶酶解產(chǎn)物飼喂海參，通過(guò)定期監(jiān)控海參體質(zhì)量變化及測(cè)定海參體壁相關(guān)免疫因子（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量），探究酶解海帶產(chǎn)物對(duì)海參體質(zhì)量及免疫相關(guān)酶活性的影響。為研制具有免疫調(diào)節(jié)功能的綠色海參餌料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

假單胞菌（Pseudomonassp.）H0-5：本實(shí)驗(yàn)室保藏。海參：大連北大水產(chǎn)有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

鐵氰化鉀（分析純）、苯酚（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙酸鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硼酸（分析純）：天津博迪化學(xué)股份有限公司；4-氨基安替吡啶（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；2-硫代巴比妥酸（分析純）：上?？曝S化學(xué)試劑有限公司；磷酸苯二鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四水合鉬酸銨（分析純）：西隴化工股份有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白分析試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

756MC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；iMark酶標(biāo)儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；MIKKO 220R臺(tái)式高速離心機(jī)：德國(guó)Hettich公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器：日本SANYO電氣公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)飼料的制備

利用本實(shí)驗(yàn)室自有菌株H0-5產(chǎn)酶對(duì)海帶進(jìn)行降解，根據(jù)前期研究成果表明，在裝樣量為40%、接種量為1%，培養(yǎng)溫度為20℃、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下培養(yǎng)22 h酶活最高，收集粗酶液，加入處理好的海帶（1 cm2方塊，自來(lái)水泡發(fā)），20℃、150 r/min水浴搖床反應(yīng)，24 h時(shí)培養(yǎng)瓶中肉眼已經(jīng)看不見(jiàn)海帶碎塊即為降解完全，經(jīng)過(guò)濾得到上清，后經(jīng)噴霧干燥制取海帶寡糖粉末；所得沉淀經(jīng)冷凍干燥制成海帶泥粉末。

1.3.2 海參養(yǎng)殖

將購(gòu)買(mǎi)的健康海參（成參）以每組20只，且以平均體質(zhì)量為（2.60±0.70）g為標(biāo)準(zhǔn)分為10組，飼養(yǎng)于水池中，采用海參生長(zhǎng)適宜條件[14]：溫度（15～17℃）、鹽度（29‰～31‰）、pH（7.7～7.9）、養(yǎng)殖水（海水）、進(jìn)排水（晚上換水一次）、餌料投喂（早上喂基礎(chǔ)飼料一次）。通過(guò)觀察海參每日進(jìn)食與排便情況確定海參狀態(tài)是否穩(wěn)定，待穩(wěn)定后展開(kāi)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分為海帶泥組、海帶寡糖組和對(duì)照組。對(duì)照組飼喂100%基礎(chǔ)海參飼料，海帶寡糖組飼喂含不同含量（0.5%、2.5%、5.0%、10.0%）海帶寡糖的基礎(chǔ)飼料，海帶泥組飼喂含不同含量（25%、50%、75%、100%）海帶泥的基礎(chǔ)飼料。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每10 d記錄海參質(zhì)量，5個(gè)循環(huán)后解剖海參，測(cè)定海參體壁組織液中免疫相關(guān)因子（SOD、CAT、POD、ACP、AKP、MDA）。海參生長(zhǎng)率計(jì)算公式如下：

1.3.3 海參體壁組織液的制備[15]

新鮮的海參去內(nèi)臟，用去離子水洗凈體壁，取相同部位體壁1 g，剪碎后于冰水浴中研磨，加入9 mL預(yù)冷無(wú)菌生理鹽水，收集體壁組織研磨液，4℃、4 000 r/min離心10 min，取上清，分裝置于-80℃冰箱中備用。

1.3.4 分析檢測(cè)

（1）海參體壁組織中蛋白濃度的測(cè)定

采用BCA法蛋白分析試劑盒對(duì)海參提取樣品中蛋白總量進(jìn)行測(cè)定。

（2）海參體壁中相關(guān)免疫因子活力測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）采用SOD試劑盒測(cè)定[16-18]；酸性磷酸酶（ACP）采用磷酸苯二鈉法[19-21]；堿性磷酸酶（AKP）采用磷酸苯二鈉法[19-21]；過(guò)氧化氫酶（CAT）采用鉬酸銨法[22-27]；過(guò)氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚法[28-30]；丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法[31]。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性水平設(shè)為P＜0.05，極顯著性水平設(shè)為P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶寡糖及海帶泥對(duì)海參質(zhì)量增長(zhǎng)的影響

以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)（100%）為對(duì)照組，不同含量海帶寡糖和海帶泥添加組為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)總時(shí)長(zhǎng)為50 d，每隔10 d測(cè)定海參體質(zhì)量，比較10組海參體質(zhì)量總生長(zhǎng)率，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，對(duì)照組海參總生長(zhǎng)率為（7.3±0.64）%，海帶寡糖組海參生長(zhǎng)率均高于對(duì)照組，且海參體質(zhì)量生長(zhǎng)率隨飼料中海帶寡糖含量呈濃度依賴(lài)性，10%時(shí)最高，為（76.60±2.49）%。海帶泥含量為25%時(shí)，海參質(zhì)量總生長(zhǎng)率最高，為（40.30±2.45）%，但海參體質(zhì)量生長(zhǎng)率隨著飼料中海帶泥含量增加而減少，海帶泥占比100%時(shí)海參質(zhì)量生長(zhǎng)率低于對(duì)照組。結(jié)果表明，酶解海帶寡糖對(duì)海參生長(zhǎng)具有極顯著的促進(jìn)作用（P＜0.01），在合理添加范圍內(nèi)（≤10%），海參體質(zhì)量長(zhǎng)率隨海帶寡糖添加量的增加而增加。海帶泥的促增長(zhǎng)作用明顯弱于海帶寡糖，且基礎(chǔ)飼料成分比例過(guò)低（≤20%）時(shí)，海參的生長(zhǎng)率反而下降。

圖1 海帶寡糖及海帶泥添加量對(duì)海參生長(zhǎng)率的影響Fig.1 Effect ofLaminaria japonicaoligosaccharide and mud additions on growth rate of sea cucumber

2.2 海帶寡糖及酶解海帶泥對(duì)海參體壁組織超氧化物歧化酶活力影響

圖2 海帶寡糖及海帶泥添加量對(duì)海參體壁組織超氧化物歧化酶活性的影響Fig.2 Effect ofLaminaria japonicaoligosaccharide and mud additions on superoxide dismutase activities in sea cucumber perisome tissue

SOD廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成H2O2和O2。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，而且是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。以基礎(chǔ)飼料（100%）喂養(yǎng)為對(duì)照組，不同含量海帶寡糖和海帶泥添加組為實(shí)驗(yàn)組，50 d后收集海參體壁液，用SOD試劑盒檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，海帶寡糖添加量為0.5%時(shí)，海參體壁組織中SOD活力最高，為20.847 U/mg（P＜0.05），其他組SOD活力增長(zhǎng)并不顯著（P＞0.05）；降解海帶泥組中各組海參體壁組織中SOD活力雖隨海帶泥添加量呈梯度增加，但作用均不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，酶解海帶產(chǎn)物均能提高海參體壁組織中SOD活力，其中0.5%海帶寡糖組能夠顯著提高海參體壁組織中SOD活力（P＜0.05）。

2.3 海帶寡糖及酶解海帶泥對(duì)海參體壁組織中過(guò)氧化氫酶活力的影響

圖3 海帶寡糖及海帶泥添加量對(duì)海參體壁組織過(guò)氧化氫酶活性的影響Fig.3 Effect ofLaminaria japonicaoligosaccharide and mud additions on catalase activities in sea cucumber perisome tissue

CAT是過(guò)氧化物酶體的標(biāo)志酶，能夠催化過(guò)氧化氫分解成氧和水，使細(xì)胞免受過(guò)氧化氫的損傷。以基礎(chǔ)飼料（100%）喂養(yǎng)為對(duì)照組，不同含量海帶寡糖和海帶泥添加組為實(shí)驗(yàn)組，50 d后收集海參體壁液，用鉬酸銨法檢測(cè)CAT活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，酶解海帶寡糖與酶解海帶泥作用于海參后，海參體壁組織內(nèi)CAT活力均有顯著升高，且相較于對(duì)照組均有極顯著性差異（P＜0.01），其中海帶寡糖與海帶泥添加量分別為0.5%和75%時(shí)，CAT活力最高，分別為65.74 kU/mg和69.17 kU/mg。結(jié)果表明，酶解海帶寡糖和酶解海帶泥均能夠保護(hù)海參免受氧化損傷的作用。

2.4 海帶寡糖及酶解海帶泥對(duì)海參體壁組織內(nèi)過(guò)氧化物酶活力影響

圖4 海帶寡糖及海帶泥添加量對(duì)海參體壁組織過(guò)氧化物酶活性的影響Fig.4 Effect ofLaminaria japonicaoligosaccharide and mud additions on peroxidase activities in sea cucumber perisome tissue

POD是體內(nèi)過(guò)氧化物酶體的另一種代表酶，與CAT一起清除體內(nèi)多余的過(guò)氧化氫。以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)（100%）為對(duì)照組，不同含量海帶寡糖和海帶泥添加組為實(shí)驗(yàn)組，50 d后收集海參體壁液，用愈創(chuàng)木酚法檢測(cè)POD活性，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，酶解海帶寡糖添加量為5%時(shí)海參體壁組織中POD有最大活力，為8.135 U/mg，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0.05），但酶解海帶泥對(duì)海參體壁組織中POD活力均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

2.5 海帶寡糖及酶解海帶泥對(duì)海參體壁組織堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活力的影響

圖5 海帶寡糖及海帶泥添加量對(duì)海參體壁組織酸性磷酸酶（A）及堿性磷酸酶（B）活性的影響Fig.5 Effect ofLaminaria japonicaoligosaccharide and mud additions on acid phosphatase(A)and alkaline phosphatase(B)activities in sea cucumber perisome tissue

堿性磷酸酶（AKP）在機(jī)體內(nèi)可催化各種醇和酚的磷酸酯進(jìn)行水解，在細(xì)胞膜上較為活躍。酸性磷酸酶（ACP）與核酸和蛋白質(zhì)代謝活動(dòng)相關(guān)，也可參與脂類(lèi)的代謝，對(duì)于機(jī)體免疫有重要的生物學(xué)意義。以基礎(chǔ)飼料（100%）喂養(yǎng)為對(duì)照組，不同含量海帶寡糖和海帶泥添加組為實(shí)驗(yàn)組，50 d后收集海參體壁液，用磷酸苯二鈉法檢測(cè)AKP及ACP活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，與對(duì)照組相比海帶寡糖對(duì)海參體內(nèi)ACP和AKP的產(chǎn)生都有顯著的促進(jìn)作用（P＜0.01），但是酶活與添加量呈負(fù)劑量依賴(lài)性。0.5%的海帶寡糖對(duì)海參體內(nèi)ACP和AKP產(chǎn)生的促進(jìn)作用最強(qiáng)，分別為22.62U/mg（對(duì)照組7.62 U/mg）和42.65 U/mg（對(duì)照組7.17 U/mg）。而海帶泥對(duì)海參體內(nèi)ACP活力的影響不顯著（P＞0.05），對(duì)AKP的活力有顯著的提高作用（P＜0.01）（50%添加量最佳），但是其提高作用低于海帶寡糖。

2.6 海帶寡糖及酶解海帶泥對(duì)海參體內(nèi)丙二醛含量影響

圖6 海帶寡糖及海帶泥添加量對(duì)海參體壁組織丙二醛含量的影響Fig.6 Effect ofLaminaria japonicaoligosaccharide and mud additions on malondialdehyde contents in sea cucumber perisome tissue

MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化物，可以反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度。以基礎(chǔ)飼料（100%）喂養(yǎng)為對(duì)照組，不同含量海帶寡糖和海帶泥添加組為實(shí)驗(yàn)組，50 d后收集海參體壁液，用TBA法檢測(cè)MDA含量，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，對(duì)照組海參體壁組織中MDA含量均極顯著高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01），其中以寡糖添加量和酶解海帶泥添加量分別為10%和25%時(shí)最少，具有極顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)果表明，海帶寡糖及海帶泥均能顯著性抑制機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同添加劑量的酶解海帶寡糖和酶解海帶泥對(duì)海參體質(zhì)量及海參體壁液中免疫相關(guān)因子活力的影響，結(jié)果表明，酶解海帶寡糖及酶解海帶泥對(duì)海參體質(zhì)量增長(zhǎng)均有一定的促進(jìn)作用，其中海帶寡糖的促進(jìn)作用高于海帶泥，其促進(jìn)作用與添加劑量呈正相關(guān)。海帶寡糖對(duì)海參體壁中免疫相關(guān)因子活力有一定的提高作用，其中0.5%添加量的海帶寡糖的作用最顯著。結(jié)果表明，酶解海帶寡糖作為海參廉價(jià)高效的免疫增強(qiáng)劑和飼料添加劑具有一定的應(yīng)用前景。