周斐成，吳生文，朱慶圣，廖 昶，李雪亮，吳曉玉*，丁忠濤，崔立操

（1.江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；3.四特酒有限責任公司，江西 南昌 330046）

大曲提供了白酒發(fā)酵所需要的微生物，也是一種復(fù)合酶制劑、形成白酒復(fù)雜風(fēng)味成分的前驅(qū)物質(zhì)[1]。大曲品質(zhì)對曲酒的出酒率和酒質(zhì)都有極大影響，常有“曲為酒之骨”[2]。中國白酒根據(jù)風(fēng)味可分為醬香型、濃香型、清香型和特香型等[3]，白酒特殊風(fēng)味來源于參與白酒發(fā)酵的微生物的種類和數(shù)量，大曲的品質(zhì)直接關(guān)系到白酒品質(zhì)，也直接影響到白酒的風(fēng)格特征及其風(fēng)味[4]。而以四特酒為代表的特香型白酒，具有“清香醇純，回味無窮”特性，深受消費者喜愛。特香型白酒大曲制曲采用的原料為面粉、麥麩和丟糟，在我國獨一無二，特色明顯[5]。傳統(tǒng)大曲品質(zhì)評定通常局限于感官評定，隨著監(jiān)測手段和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大曲的理化指標及酶系變化也成為考量大曲質(zhì)量優(yōu)劣的重要因素。近年來，專家們研究了不同類型酒曲生產(chǎn)過程中理化指標和水解酶系的動態(tài)變化。班世棟等[6]對醬香型的3種大曲的水解酶系進行研究，結(jié)果表明，隨著貯存時間的延長，大曲的酶活變化趨勢不同，大曲酶活大多在新曲和貯存3個月時達到最高，適宜的酶活力決定了白酒的品質(zhì)，大曲中的酶活力在貯存過程中一般有降低的趨勢，但在貯存過程中風(fēng)味物質(zhì)也在不斷積累。王曉丹等[7]對濃香型大曲中酶系與白酒品質(zhì)關(guān)系進行了研究，結(jié)果表明，大曲的生化性能，對酒質(zhì)的優(yōu)劣和白酒產(chǎn)量的高低有著決定作用。王俏等[8]對不同香型酒曲的理化性能進行對比分析，結(jié)果表明，從水分上看，特香型的水分含量最高，豉香型水分含量最低；從酸度上來看，醬香型曲最高，豉香型最低；從糖化力來看，清香型曲的糖化力最高，醬香型曲的最低等，不同香型的大曲的理化性能各不相同，這也是不同香型大曲特有風(fēng)格形成的重要原因之一。但是目前國內(nèi)外對于特香型白酒大曲的研究較少，為了了解特香型大曲在制曲過程中理化指標及其水解酶系的變化規(guī)律，本研究以特香型大曲為研究對象，采用國家標準測定方法在夏秋兩季對曲塊不同層面的各種理化指標及水解酶系進行檢測分析，旨在為特香型白酒制曲生產(chǎn)以及工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

特香型大曲：四特酒有限公司；碘、干酪素：美國Sigma公司；可溶性淀粉、硫代硫酸鈉、乳酸鈉：天津大茂化學(xué)試劑廠；檸檬酸、乳酸：上海山浦化工有限公司；三氯乙酸、羧甲基纖維素鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；L-酪氨酸：上海藍季科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNA）：北京索萊寶生物工程技術(shù)有限責任公司；己酸：上海晶純試劑有限公司；淀粉含量測定試劑盒：蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；液化型淀粉酶（α-淀粉酶）：南京建成生物科技有限公司。實驗所用化學(xué)試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004B電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；PHS-3G雷磁電子pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TCL20M高速冷凍離心機：常州百密思儀器有限公司；HH-3數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；ZFD-5040電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；T1可見光分光光度計：上海屹譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

（1）大曲采集

2017年6月份及10月份從四特酒有限責任公司采集特香型大曲（制曲期0～20d）。隨機選定3個曲房，每個房間每5d從不同位置選取3塊大曲。

（2）大曲樣品收集

采集的大曲為磚型（27cm×17cm×7～8 cm），分外、中、內(nèi)三層收集樣品。大曲由外至內(nèi)1 cm厚區(qū)域設(shè)為曲表層（曲皮）；曲表與曲心之間顏色較深，設(shè)為中層（火圈層）；火圈層以內(nèi)、曲中心2 cm區(qū)域設(shè)為內(nèi)層（曲心）。分別收集三層樣品，粉碎，混勻過篩后，稱取200 g，置4℃冰箱貯存。

1.3.2 大曲理化指標及水解酶系的測定方法

（1）水分、酸度的測定

水分、酸度的測定方法參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[9]。水分含量及酸度計算公式如下：

式中：X為水分含量，g/100 g；m1為烘干前稱量瓶加試樣的質(zhì)量，g；m2為烘干后稱量瓶加試樣的質(zhì)量，g；m為恒質(zhì)量稱量瓶的質(zhì)量，g。

式中：X為酸度，mmol/10 g；c為氫氧化鈉標準溶液的濃度，mo1/L；V1為滴定試樣時，消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V0為空白試驗時，消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；200為試樣稀釋體積，mL；20為取樣液進行滴定的體積，mL。

（2）淀粉含量的測定

采用淀粉含量試劑盒測定大曲中淀粉含量。即利用體積分數(shù)為80%乙醇把樣品中可溶性糖與淀粉分開，進一步采用酸水解法分解淀粉為葡萄糖，采用蒽酮比色法測定葡萄糖含量，其計算公式如下：

式中：X為淀粉含量，mg/g；A為620 nm條件下測定的吸光度值；W為樣本質(zhì)量，g。

（3）酸性蛋白酶活力的測定

酸性蛋白酶酶活測定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[10]。酸性蛋白酶酶活定義：1 g干曲，在40℃、pH 3.0條件下，1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需的酶量為1個酶活力單位（U/g）。

（4）纖維素酶活力的測定

纖維素酶活力的測定采用DNS法，參照QB2583—2003《纖維素酶制劑》[11]。纖維素酶酶活定義：1 g固體酶（或1 mL液體酶），在（50±0.1）℃、指定pH條件下（酸性纖維素酶pH 4.8，中性纖維素酶pH 6.0），1 h水解羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生出相當于1 mg葡萄糖的還原糖量，為1個酶活力單位（U/g）。

（5）糖化酶活力的測定

采用次碘酸鹽法，參照GB8276—2006《糖化酶制劑》[12]。糖化酶酶活定義：在40℃、pH4.6條件下，1h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成1mg葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U/g）。

（6）液化型淀粉酶活力的測定

采用α-淀粉酶試劑盒對大曲液化型淀粉酶活力進行測定。液化型淀粉酶酶活定義：1g樣本中的淀粉酶，在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉為1個酶活單位（U/g）。

（7）酯化力的測定

在大曲中，酯酶的作用是催化一個酸基和一個醇基反應(yīng)酯化，所以以己酸乙酯的含量來定義大曲的酯化力。酯化力的檢測方法參照沈怡方[13]《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》。酯化力定義為：1 g大曲在30～32℃，經(jīng)過100 h催化己酸和乙醇合成1 mg己酸乙酯定義為一個酶活單位（mg/g）。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

運用Excel2007對實驗數(shù)據(jù)進行整理并進行統(tǒng)計處理，實驗結(jié)果以平均值表示，并算出其標準偏差，采用Origin9.0軟件對理化指標和水解酶系實驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 特香型大曲的理化指標

2.1.1 含水量

大曲含水量是一個非常重要的指標，水分在制曲期與大曲中微生物的生長和各種酶的產(chǎn)生息息相關(guān)。由于四特酒廠7、8月份停止生產(chǎn)大曲，6月和10月是夏季和秋季具有代表性的月份，因此，對6月和10月發(fā)酵期間大曲不同層面含水量進行測定，結(jié)果見圖1。

圖1 6月（A）及10月（B）大曲樣品含水量變化Fig.1 Changes of water contents of Daqu samples in June(A)and October(B)

由圖1可知，6月和10月大曲各層樣品含水量均隨制曲時間的延長而呈下降趨勢。最初含水量在45%左右，20 d出房時，6月、10月大曲樣品含水量分別為13.612%、16.37%，此時曲心含水量最多，6月和10月曲心含水量分別為19.34%、24.79%，曲表層含水量最少，6月和10月曲表層含水量分別為7.81%、11.45%。0～5 d，曲表層含水量下降最為劇烈，6月、10月分別下降了58.51%、54.15%。這是由于霉菌等微生物大量生長繁殖產(chǎn)熱，曲房溫度升高，大曲水分被蒸發(fā)和消耗。而曲心位于最里層，微生物生長緩慢，曲心溫度相對較低，濕度相對其他兩層都較高。在制曲時間內(nèi)，6月大曲各層含水量均比10月大曲樣品低，主要原因是6月的溫度比10月高，濕度比10月份低。因此，含水量的變化不僅與大曲分層有關(guān)，還與所處季節(jié)的溫度、濕度有關(guān)。

2.1.2 酸度

大曲酸度的形成主要來源于生酸微生物進行的有機酸代謝以及脂肪、淀粉和蛋白質(zhì)的降解，是大曲微生物綜合作用的結(jié)果。適宜的酸度可抑制大曲中部分有害雜菌生長，同時也為有益微生物提供營養(yǎng)和參與酯化反應(yīng)生成香味物質(zhì)[14]。采用酸堿中和電位滴定法[9]，對6月和10月發(fā)酵期間大曲不同層面酸度進行測定，結(jié)果見圖2。

圖2 6月（A）及10月（B）大曲樣品酸度變化Fig.2 Changes of acidity of Daqu samples in June(A)and October(B)

由圖2可知，酸度總體趨勢先上升后緩慢下降。0～5 d大曲各層酸度值迅速上升，隨后曲表層與曲心酸度下降，而火圈層保持緩慢上升趨勢。第10天后，表層曲呈現(xiàn)緩慢上升而后略有下降，曲心在第15天后酸度下降趨于緩和。制曲不同時期的酸度測定結(jié)果顯示，6月出房大曲曲表層、火圈層、曲心的酸度值分別為1.69mmol/10g、4.49mmol/10g、1.98mmol/10g；10月出房大曲曲表層、火圈層、曲心的酸度值分別為0.82 mmol/10 g、2.26 mmol/10 g、0.77 mmol/10 g，6月不同層面酸度明顯高于10月。6月曲房溫度高，大曲內(nèi)部散熱慢，溫度迅速上升，微生物大量生長繁殖，造成曲內(nèi)部缺氧，酸性物質(zhì)大量生成。

2.1.3 淀粉含量

淀粉含量也是評價大曲好壞的一個重要指標。采用淀粉含量試劑盒，對6月和10月發(fā)酵期間大曲不同層面淀粉含量進行測定，結(jié)果見圖3。

圖3 6月（A）及10月（B）大曲樣品淀粉含量變化Fig.3 Changes of starch contents of Daqu samples in June(A)and October(B)

由圖3可知，淀粉含量為曲心＞火圈層＞曲表層，表明曲心淀粉利用率最低，曲表層淀粉利用率最高。大曲淀粉含量在制曲過程中先上升后下降，0～5d淀粉含量上升，6月出房大曲淀粉含量增加了7.24mg/g，10月出房大曲淀粉含量增加了2.09mg/g，推測大曲中部分物質(zhì)被微生物降解成不溶性多糖，造成淀粉含量的升高假象；在5～10d，下降最為劇烈，6月和10月大曲淀粉利用率分別為39.88%、36.7%，此時淀粉利用率達到最大；10d后，淀粉含量下降減緩，甚至存在上升趨勢，說明后期微生物一方面在利用剩余的淀粉，一方面也在將其他物質(zhì)降解為不可溶性多糖。比較兩個月大曲樣品淀粉檢測結(jié)果，6月份大曲各部位淀粉含量大于10月份大曲。

2.2 特香型大曲的水解酶系分析

2.2.1 酸性蛋白酶

采用福林酚法[10]對6月和10月發(fā)酵期間大曲不同層面酸性蛋白酶活力測定，結(jié)果見圖4。

圖4 6月（A）及10月（B）大曲樣品酸性蛋白酶活力變化Fig.4 Changes of acid protease activity of Daqu samples in June(A)and October(B)

由圖4可知，曲心酸性蛋白的酶活波浪式變化明顯，6月和10月出房大曲曲心酶活均在制曲第10天最低，分別為34.61U/g、34.3 U/g，最大值在第20天，分別為80.51 U/g、132.51 U/g；6月份大曲表層酶活呈現(xiàn)先升高后幾乎趨于平穩(wěn)，最大值在第5天，為169.51 U/g，火圈層酶活則先升高后降低，最大值在第15天，為138.64U/g；10月份大曲曲表層和火圈層酶活變化趨勢較一致，均為升高后降低，第10天達最大值，分別為220.14 U/g、275.79 U/g；而火圈層酶活顯著高于曲表層。10月份大曲樣品酸性蛋白酶總體酶活高于6月份。

2.2.2 纖維素酶

纖維素酶可以將原料淀粉中3%左右的纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵性糖，再經(jīng)酵母發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精，從而提高出酒率；纖維素酶對纖維素有降解作用，能破壞間質(zhì)細胞壁的結(jié)構(gòu)，使其包含的淀粉釋放出來，有利于糖化作用[15]。采用DNS法對6月和10月發(fā)酵期間大曲不同層面纖維素酶活力測定，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，6月大曲不同部位的纖維素酶活呈先上升后下降的趨勢，其中曲表層酶活最高，發(fā)酵期間最高可達2.67 U/g，曲心最低，發(fā)酵期間最低為0.98 U/g，不同部位的酶活均在制曲第15天達到峰值，此時曲表層、火圈層、曲心酶活分別為2.67 U/g、2.37 U/g、1.80 U/g；10月大曲表層和火圈層的酶活呈先上升后下降的趨勢，曲心酶活呈波浪形變化趨勢，其中火圈層酶活最高，可達2.33 U/g，曲心酶活最低，為0.43 U/g。不同月份的大曲的纖維素酶活變化趨勢不一致，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因有很多。大曲中纖維素酶來源廣泛，細菌、真菌和放線菌都有產(chǎn)纖維素酶的能力[16]。不同的溫度、濕度以及酸度同樣會導(dǎo)致酶活變化。

圖5 6月（A）及10月（B）大曲樣品纖維素酶活力變化Fig.5 Changes of cellulase activity of Daqu samples in June(A)and October(B)

2.2.3 液化型淀粉酶

大曲中液化型淀粉酶又稱α-淀粉酶，主要作用是將淀粉水解為小分子的糊精。酒曲中液化型淀粉酶主要來源于枯草芽孢桿菌、米曲霉、白曲霉、黑根霉等微生物[17]。采用α-淀粉酶試劑盒，對6月和10月發(fā)酵期間大曲不同層面液化型淀粉酶活力進行檢測，結(jié)果見圖6。

圖6 6月（A）及10月（B）大曲樣品液化型淀粉酶活力變化Fig.6 Changes of liquefied amylase activity of Daqu samples in June(A)and October(B)

由圖6可知，在制曲期0～5 d，6月和10月大曲曲心液化型淀粉酶酶活迅速下降，分別下降了11.07 U/g、11.78 U/g，而外層與火圈層酶活力略有升高；制曲期5～20d，6月大曲曲表層酶活力無明顯變化，曲心酶活升高后下降為5.14U/g，火圈層酶活下降后升高為12.30U/g，10月大曲曲表層和火圈層酶活力無明顯變化，曲心酶活升高了8.85 U/g。在整個制曲過程中，曲表層酶活最高，曲心酶活最低。

2.2.4 糖化酶

大曲的糖化酶可以直接將淀粉轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖。一般在大曲中產(chǎn)生糖化酶的菌類是霉菌[18]。糖化是白酒發(fā)酵的基礎(chǔ)，糖化酶具有糖化力，糖化力的高低與淀粉的轉(zhuǎn)化率息息相關(guān)，而糖化效果也會直接影響白酒的出酒率[19]。采用次碘酸鹽法對6月和10月發(fā)酵期間大曲不同層面糖化酶活力進行測定，結(jié)果見圖7。

圖7 6月（A）及10月（B）大曲樣品糖化酶活力變化Fig.7 Changes of saccharifying enzyme activity of Daqu samples in June(A)and October(B)

由圖7可知，在制曲期0～5 d，大曲各部位糖化酶活力差異顯著，其中曲表層酶活力最高，6月和10月大曲表層酶活分別為1801.92U/g、3183.10U/g，曲心酶活力最低，6月和10月大曲曲心酶活分別為163.74 U/g、119.0 U/g。根據(jù)其他實驗取樣檢測，0～5d是霉菌生長從快速到平穩(wěn)的時期，糖化酶活力也隨之上升-下降的波動。制曲期5～20d，火圈層和曲心酶活力保持相對平穩(wěn)狀態(tài)，表層則呈現(xiàn)先上升、后下降、再趨于平穩(wěn)的變化。6月與10月大曲糖化酶活力升降變化趨勢基本一致，但10月大曲樣品各部位糖化酶活力明顯高于6月。

圖8 6月（A）及10月（B）大曲樣品酯化力變化Fig.8 Changes in esterification power of Daqu samples in June(A)and October(B)

2.2.5 酯化力

大曲的生酯能力（酯化力）來源于大曲中的酯化功能菌和功能酶，是將醇和酸酯化成酯的能力[20]。根據(jù)文獻[13]中酯化力的測定方法，對6月和10月發(fā)酵期間大曲不同層面酯化力進行測定，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，6月大曲各部位酯化力大致都表現(xiàn)為先升高、后下降、再略上升的趨勢，10月大曲各部位酯化力表現(xiàn)為先略降低、后升高、再下降的趨勢。6月樣品火圈層酯化力在5d達到頂峰值，為64.09 mg/g，10月樣品火圈層酯化力在10 d達到頂峰值為57.23 mg/g，估計與兩個季節(jié)溫度、濕度相差比較大，造成曲霉生長快慢不同有關(guān)。制曲前期火圈層酯化力大于大曲各部位，后期曲心酯化力更高，表層酯化力一直處于最低。

2.3 夏秋兩季大曲各項檢測指標的比較

對夏秋兩季大曲從入曲房至出曲房（0～20 d）的曲總樣的各項指標進行比較，結(jié)果見表1。由表1可知，夏季（6月）大曲各時期含水量低于秋季（10月），而酸度值明顯高于10月，淀粉含量同樣高于10月；酸性蛋白酶、糖化酶活力則是10月遠高于6月；液化型淀粉酶活力、酯化力在制曲5 d前，6月高于10月，10 d以后則是后者高于前者；纖維素酶活力大小情況相反，制曲5d前，6月份低，10d后，6月高于10月。夏季（6月）最高氣溫平均27.8℃，最低氣溫平均22.3℃；秋季（10月）最高平均為22.5℃，最低14.7℃。6月份氣溫明顯高于10月，秋季溫度更適宜微生物的生長繁殖。從整個制曲過程檢測數(shù)據(jù)及出房新曲（20d）數(shù)據(jù)看，秋季（10月）大曲優(yōu)于夏季（6月）大曲。

表1 夏秋兩季大曲樣品中各項指標的比較Table 1 Comparison of each index of Daqu samples of summer and autumn

出房新曲（制曲20 d）不同層次比較，結(jié)果見表2。由表2可知，糖化酶活力差異最顯著，曲表層＞火圈層＞曲心；其次為含水量差異明顯，曲表層＜火圈層＜曲心；酸度值為火圈層最高，曲表層和曲心差異不明顯。從總體上看，曲表層糖化酶活力最高；曲心液化型淀粉酶活力、糖化酶活力、酸性蛋白酶活力最低，酯化力、淀粉含量偏高；火圈層居于兩者之間。6月新曲各層的酸度值、淀粉含量、纖維素酶活性均高于10月；含水量、酸性蛋白酶、液化型淀粉酶、糖化酶活力和酯化力則均低于10月，尤其是糖化酶活力差異更為顯著。進一步表明秋季大曲的質(zhì)量優(yōu)于夏季大曲。

表2 新曲樣品不同部位各項指標的比較Table 2 Comparison of each index of different part of new Daqu sample

3 討論

固態(tài)發(fā)酵大曲酒的大曲具有糖化、發(fā)酵、生香等功能，其質(zhì)量直接影響大曲酒的產(chǎn)量與品質(zhì)。大曲曲塊不同部位因通氣狀況、二氧化碳濃度、水分、溫度等微環(huán)境的差異而呈現(xiàn)不同的理化特性。縱觀不同香型大曲酒的大曲研究均顯示類似結(jié)果。清香型汾酒大曲曲皮糖化力800～1400[mg/（g·h）]較曲心糖化力400～800[mg/（g·h）]整體偏高[21]，濃香型國窖曲曲心的糖化力比曲表層低53.60%，而酯化力較曲表層高116.84%[22]。本研究特香型四特酒的糖化力曲表層2 177～3 056 U/g，顯著高于火圈層、曲心，其酯化力則是曲心、火圈層高于曲表層，與其他白酒大曲規(guī)律類似。

周國紅等[23]認為白酒的質(zhì)量、香味物質(zhì)的產(chǎn)生以及風(fēng)格的形成與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的種類多少、含量高低密切相關(guān)。關(guān)于白酒大曲火圈層的水解酶系、酸度、含水量等特性均鮮有報道。本研究顯示，特香型白酒大曲火圈層酸度明顯高于曲表層、曲心，在制曲前期火圈層酯化力大于大曲各部位，液化力與糖化力低于曲表層、高于曲心。

4 結(jié)論

通過對6月和10月特香型大曲制曲期間的各項理化指標和水解酶系的測定顯示，6月大曲各層含水量均比10月大曲樣品低，酸度明顯高于后者，各部位淀粉含量大于10月大曲；而大曲各類水解酶（酸性蛋白酶、液化型淀粉酶、糖化酶、酯化力等）在制曲期均有升降動態(tài)變化，但總體水平為10月高于6月大曲。夏季溫度高、濕度大，大曲微生物生長過快，造成升溫過猛，造成微生物生長繁殖不充分，從而影響大曲質(zhì)量。