王毅鈞， 李瑞平， 李力波， 陳實(shí)， 張玉奇， 李小悅△

1東莞市人民醫(yī)院胃腸外科(廣東東莞 523059)； 2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院胃腸外科(廣東廣州 510655)； 3桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院急診科(廣西桂林 541000)

結(jié)直腸癌中不僅包含惡性腫瘤細(xì)胞，還包含許多其他非惡性細(xì)胞類型如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和各種浸潤免疫細(xì)胞[1]。此外，對(duì)于目前結(jié)直腸癌的TNM分型方法并未能充分反映結(jié)直腸癌的腫瘤生物學(xué)行為和患者預(yù)后[2]。因此，確定生物標(biāo)志物以預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)展和進(jìn)展具有重要意義。目前多項(xiàng)研究[3-4]表明，免疫細(xì)胞浸潤可以顯著影響病程的進(jìn)展和預(yù)后。其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)通常構(gòu)成浸潤免疫的重要組成部分細(xì)胞，TAMs是參與腫瘤微環(huán)境和炎癥的重要組成部分，其起源于循環(huán)單核細(xì)胞，并通過招募到腫瘤組織中。同時(shí)，不同的微環(huán)境可能導(dǎo)致兩種不同的極化TAMs：經(jīng)典激活型M1表型和可選激活的M2表型[5]。M1巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是促進(jìn)炎癥反應(yīng)和抗腫瘤活性。M2巨噬細(xì)胞主要是參與抗炎反應(yīng)，組織重塑，血管生成和腫瘤細(xì)胞活化。雖然TAMs在腫瘤微環(huán)境中的作用及其預(yù)后價(jià)值已經(jīng)被表明具有明確的相關(guān)性，但在不同的腫瘤中對(duì)預(yù)后具有不同的影響。如在乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、胃癌和頭頸部腫瘤中[8]，TAMs密度高的患者預(yù)后不良。但是，既往的研究表明，癌組織中TAMs密度高的結(jié)直腸癌患者具有更好的預(yù)后[9]。因此目前對(duì)于TAMs在結(jié)直腸癌組織中與臨床特征的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響仍然具有爭(zhēng)議[10-13]，本研究旨在進(jìn)一步明確TAMs與結(jié)直腸癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月至2016年3月于我院行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本共120例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理確診為結(jié)直腸癌；(2)行手術(shù)治療的患者；(3)病歷資料完整的患者；排除不能獲得完整隨訪的患者；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。120例結(jié)直腸癌患者中均選擇其癌組織作為觀察組，選擇癌旁組織作為對(duì)照。納入的120例患者中，男74例，女46例，年齡33～87歲，平均(56.4±12.8)歲。其中腫瘤位于結(jié)腸共65例，位于直腸55例，TNM分期為Ⅰ～Ⅳ期。

1.2 病理學(xué)檢查 所有手術(shù)組織均由本院病理科處理，將來自甲醛溶液固定標(biāo)本的石蠟塊切成5 μm并用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)，采用蘇木素和伊紅染色切片對(duì)腫瘤進(jìn)行分級(jí)。

免疫組化方法：將5 μm厚的組織切片在56℃下烘烤1 h，然后在二甲苯中脫蠟兩次，每次10 min，并在不同濃度乙醇中再水化。然后將切片在蒸餾水中沖洗并在10%蔗糖中浸泡過夜。通過在檸檬酸鹽緩沖液中煮沸30 min來進(jìn)行抗原提取。冷卻15 min后，將載玻片在pH 7.4的PBS中漂洗，在1.2%過氧化氫的甲醇溶液中溫育30 min，并在pH 7.4的PBS中沖洗15 min。然后用正常山羊血清(C0256，碧云天)將切片封閉30 min。在4℃下與兔單克隆抗人CD68抗體(#76437，CST)孵育過夜后，將載玻片在pH 7.4的PBS中洗滌3次，每次5 min，并與生物素標(biāo)記的二抗于37℃條件下孵育1 h,在pH 7.4的PBS中沖洗，然后在pH 7.5的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液中沖洗10 min。通過使用在15 mL 0.05 Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)室溫反應(yīng)2～10 min，并對(duì)切片用蘇木精復(fù)染，放置后以進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。

1.3 CD68+TAMs的評(píng)估 每張切片中選擇5個(gè)最多CD68+TAMs浸潤最多的視野，計(jì)算在高倍鏡視野下(×200)腫瘤組織及CD68+TAMs數(shù)目。具體圖像計(jì)數(shù)采用Image J軟件進(jìn)行，取5個(gè)視野中的平均CD68+TAMs數(shù)目；在120例腫瘤組織中，取中位數(shù)為每個(gè)視野>60個(gè)CD68+TAMs為高表達(dá)，≤60個(gè)CD68+TAMs為低表達(dá)。

1.4 患者資料的收集 記錄所有患者的年齡、性別、腫瘤位置、TNM分期，區(qū)域淋巴和遠(yuǎn)處結(jié)轉(zhuǎn)移的情況，記錄患者病理檢查的分化程度和組織學(xué)分級(jí)，所有患者在術(shù)后1、3、6個(gè)月返院復(fù)診，6個(gè)月后每半年返院復(fù)診，記錄患者隨訪的生存期和無病生存期。

2 結(jié)果

2.1 CD68+TAMs在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的浸潤情況 120例結(jié)直腸癌患者中的平均腫瘤組織CD68+TAMs浸潤數(shù)為(64.3±26.8)個(gè)/高倍鏡，而癌旁組織平均腫瘤組織CD68+TAMs浸潤數(shù)為(21.5±11.7)個(gè)/高倍鏡，腫瘤組織CD68+TAMs浸潤細(xì)胞數(shù)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.033,P<0.001)。

2.2 CD68+TAMs在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中CD68+TAMs細(xì)胞密度與臨床特征的關(guān)系中，其TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、區(qū)域淋巴結(jié)沒有轉(zhuǎn)移、沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ患者的CD68+TAMs高表達(dá)比例顯著高于CD68+TAMs低表達(dá)的比例(P<0.05)，而CD68+TAMs的表達(dá)在不同性別比例、年齡、腫瘤位置、浸潤深度、分化程度中的比例對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1和表1。

A：CD68+TAMs在結(jié)直腸癌組織的浸潤情況；B：CD68+TAMs在結(jié)直腸癌組織的浸潤情況(低表達(dá))；C：CD68+TAMs在結(jié)直腸癌組織的浸潤情況(高表達(dá))

圖1 CD68+TAMs在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的浸潤情況(×200)

2.3 CD68+TAMs在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 120例患者隨訪時(shí)間為3～46個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為36個(gè)月，其中62例癌組織CD68+TAMs高表達(dá)的患者中，CD68+TAMs高表達(dá)患者的總體生存率(OS)為79.0%，CD68+TAMs低表達(dá)的OS為60.3%，Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示CD68+TAMs高表達(dá)患者的OS和無病生存率(DFS)顯著優(yōu)于CD68+TAMs低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OS：HR=0.429，95%CI：0.221～0.834，P=0.013； DFS：HR=0.424，95%CI：0.230～0.782，P=0.006)。見圖2。

3 討論

在腫瘤組織中，除了與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)的遺傳和(或)獲得性遺傳因素之外，微環(huán)境對(duì)于腫瘤細(xì)胞行為，侵襲性和轉(zhuǎn)移也具有重要意義[12]。微環(huán)境因素包括腫瘤浸潤免疫細(xì)胞，包括TAMs，其一般構(gòu)成腫瘤基質(zhì)的主要成分。作為腫瘤微環(huán)境的一部分，TAMs對(duì)腫瘤進(jìn)展具有重要的作用。既往研究[13]表明，TAMs對(duì)腫瘤具有促進(jìn)和抑制兩種作用，TAMs被認(rèn)為在調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展和腫瘤生長中發(fā)揮復(fù)雜作用并且影響患者的預(yù)后、生存和轉(zhuǎn)歸，包括結(jié)直腸癌患者的預(yù)后[14]。在本研究中，我們觀察到結(jié)直腸癌組織中的CD68+TAMs表達(dá)水平顯著高于正常組織，且CD68+TAMs與臨床和病理特征包括TNM分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理分級(jí)具有密切關(guān)系。上述臨床病理特征通常與更具侵襲性的腫瘤表型和更差的患者預(yù)后相關(guān)。此外，在我們的結(jié)直腸患者隊(duì)列中，腫瘤組織的CD68+TAMs的高密度表達(dá)水平顯示了更高的OS和DFS，表明了在結(jié)直腸癌中CD68+TAMs是有利的預(yù)后因子。

表1 CD68+ TAMs在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 例(%)

本研究結(jié)果與既往CD68+TAMs在結(jié)直腸癌組表達(dá)的預(yù)后情況結(jié)果相一致。據(jù)Gulubova等[15]通過210例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中低密度的CD68+TAMs是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的不良因素。還有報(bào)道[16]稱，限制性結(jié)直腸癌中基質(zhì)CD163巨噬細(xì)胞的增加以及CD163陽性巨噬細(xì)胞浸潤增加的趨勢(shì)是更好的存活。但對(duì)于不同腫瘤中TAMs對(duì)臨床特征和預(yù)后的結(jié)果存在顯著的差異。既往的薈萃分析[11]結(jié)果顯示，高密度的TAMs在胃癌患者泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤和頭頸部腫瘤患者顯示出更差的總體生存率。因此，在評(píng)價(jià)TAMs的作用在不同的腫瘤組織中存在差異時(shí)，為何在結(jié)直腸癌中更多富集CD68+TAMs 則顯示出良好的預(yù)后，其具體的機(jī)制仍值得深入探討。

A:OS;B:DFS

由于結(jié)直腸癌中浸潤最多的為CD68+巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞代表了作為先天免疫抵御外來病原體的第防一線，巨噬細(xì)胞也可以通過腫瘤細(xì)胞和非腫瘤發(fā)生細(xì)胞區(qū)分腫瘤細(xì)胞特異性細(xì)胞膜的蛋白并隨后清除惡性細(xì)胞。TAM在抗腫瘤M1和促腫瘤M2之間的平衡中動(dòng)態(tài)地轉(zhuǎn)移表型[17]。因此，在高表達(dá)的CD68+TAMs中，可能存在更多的腫瘤M1表型的TAMs。到目前為止，腫瘤微環(huán)境中的一些因子已經(jīng)被證明與TAMs的招募和調(diào)控分化密切相關(guān)。這些刺激物包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的CSF-1，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，趨化細(xì)胞因子配體2(CCL2)，單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)[18]，還有多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-4、IL-13、IL-10、IL-33、IL-25、TGF-β等[19]。因此，對(duì)于具體不同個(gè)體和結(jié)直腸癌組織中，是否存在特異的生物標(biāo)記物調(diào)控TAMs的具體表型仍值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織較正常結(jié)腸組織中CD68+TAMs細(xì)胞數(shù)顯著增多，且癌組織CD68+TAMs與腫瘤分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高CD68+TAMs表達(dá)患者具有更好的臨床預(yù)后。