付偉金, 謝智彬, 丁啟健, 蘇明昌, 趙越, 鄭盛鋒

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科(廣西南寧 530022)

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)是GRP家族中的重要成員，與熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)有較高的同源性,是HSP 70家族的成員之一。GRP78在腫瘤組織如肝癌、結(jié)腸癌及乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等過表達(dá)，并可能與腫瘤的凋亡、耐藥密切相關(guān)[1-3]，本研究前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)GPR78在腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)中過表達(dá)，可能與RCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。進(jìn)一步研究證實(shí)GRP78過表達(dá)可能與腎癌細(xì)胞侵襲力及增殖等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[6]。研究表明上皮間質(zhì)變(epithelial mesenchymal transition,EMT)和腫瘤細(xì)胞侵襲力密切相關(guān)[7-8]。但GPR78如何調(diào)控腎癌細(xì)胞侵襲力，與EMT是否存在調(diào)節(jié)關(guān)系，以及通過何種信號通路調(diào)控細(xì)胞侵襲力，相關(guān)機(jī)制還不清楚。2016年9月至2017年12月本項(xiàng)目探討慢病毒RNA干擾GRP78表達(dá)后對腎癌細(xì)胞侵襲力、EMT的影響及可能的相關(guān)信號調(diào)控通路，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎癌細(xì)胞株786-0細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、10%胎牛血清、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，慢病毒siRNA購自上海漢恒公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，PCR引物由上海生工公司合成，GRP78、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、p-PI3K、p-Akt抗體、GAPDH購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 腎癌細(xì)胞株786-0在RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)(含10%胎牛血清，5%CO2、37℃)。將處于對數(shù)生長期的786-0細(xì)胞按說明書用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液和試劑轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)6 h后更換含有10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，慢病毒siRNA-GRP78干擾序列按文獻(xiàn)[6]報(bào)道設(shè)計(jì)，干擾序列GAGCGCATTGATACTAGAAAT。轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，隨機(jī)選取10個視野拍照，并用Image Pro Plus軟件計(jì)數(shù)分析，對照組不做任何處理，僅添加等量PBS。

1.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲力 Transwell小室內(nèi)鋪滿無血清培養(yǎng)液稀釋的基質(zhì)膠，取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，將濃度為5×106·mL-1的細(xì)胞懸液加入上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液；培養(yǎng)48 h后，取出小室，PBS洗滌，棉簽拭去小室上層未穿出細(xì)胞和基質(zhì)膠，95%乙醇固定，用0.1%結(jié)晶紫染色。觀察照相(×200)，按每組不少于4個隨機(jī)視野計(jì)數(shù)穿出細(xì)胞,各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞克隆檢測細(xì)胞增殖能力 各組轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞以500個/孔均勻接種于 6孔板,置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，10 d后當(dāng)肉眼可見克隆形成時(shí)，終止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，用4%甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色后拍照，計(jì)算肉眼可見的細(xì)胞克隆數(shù)目，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 各組轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底層時(shí)，用無菌200 μL加樣槍頭對細(xì)胞進(jìn)行劃痕損傷，每孔劃痕1次，48 h后在顯微鏡下對每板的劃痕隨機(jī)選5個區(qū)域進(jìn)行拍照，倒置顯微鏡下觀察拍照(×100)，根據(jù)細(xì)胞間距計(jì)算遷移率，細(xì)胞遷移率=(愈合后間距/起始間距)×100%。

1.6 免疫蛋白印跡(Western blot)檢測蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，用細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔上40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后，加兔抗小鼠GRP78單克隆抗體，4℃過夜。洗滌后加二抗室溫孵育2 h，洗滌，DAB顯色，成像，GAPDH作為內(nèi)參，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 干擾GPR78對腎癌細(xì)胞侵襲力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組(295±12.8)個/視野細(xì)胞相比，siRNA組腎癌細(xì)胞明顯減少，為(89.6±10.8)個/視野，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示慢病毒RNA干擾GRP78后可抑制腎癌細(xì)胞侵襲力。見圖1和表1。

A:對照組；B：siRNA組

項(xiàng)目n細(xì)胞克隆能力細(xì)胞侵襲力對照組3267.33±13.50307.33±19.42siRNA組3125.00±10.81?207.00±17.52?F值203.0444.13P值0.0000.009

*與對照組比較P<0.05

2.2 干擾GPR78對腎癌細(xì)胞克隆增殖能力的影響 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組(281±21.8)個/孔相比，siRNA組腎癌細(xì)胞克隆(123±8.8)個/孔數(shù)量下降,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示慢病毒RNA干擾GRP78后可抑制腎癌細(xì)胞克隆增殖能力。見圖2和表1。

2.3 干擾GPR78對腎癌細(xì)胞遷移活性的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，siRNA組腎癌細(xì)胞遷移率下降,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示慢病毒RNA干擾GRP78后可抑制腎癌細(xì)胞遷移能力。見圖3。

A:對照組；B：siRNA組

A:對照組；B：siRNA組

2.4 干擾GRP78對E-cadherin、N-cadherin、vimentin、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，siRNA組E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；N-cadherin、vimentin、p-PI3K、p-Akt表達(dá)下調(diào)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，提示慢病毒RNA干擾GRP78后可促進(jìn)EMT上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)上達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞N-cadherin、vimentin表達(dá)下調(diào)，同時(shí)抑制PI3K/Akt信號通路中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)，提示慢病毒RNA干擾GRP78后可逆轉(zhuǎn)腎癌細(xì)胞EMT。見圖4和表2。

圖4 Western blot檢測兩組蛋白表達(dá)

3 討論

RCC是泌尿系常見腫瘤。局限性RCC通過根治性手術(shù)可獲得治療，30%患者確診已為晚期或轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移或晚期RCC患者5年生存率<10%[9]。因此早期診斷和尋找治療新靶點(diǎn)對于RCC的治療十分重要。越來越多的證據(jù)表明GRP78可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究前期發(fā)現(xiàn)GRP78在腎癌細(xì)胞組織中呈過表達(dá)[5-6]。與我們的研究結(jié)果一致，Kuroda等[10]也報(bào)道了GRP78在腎癌組織中過表達(dá)，并與RCC預(yù)后、復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，提示GRP78可能與腎癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。與Lin等[11]和Kazushi等[12]研究結(jié)果相似，本研究前期發(fā)現(xiàn)沉默GRP78會促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[6]，本研究還發(fā)現(xiàn)沉默GRP78后可抑制腎癌細(xì)胞侵襲力，降低細(xì)胞克隆及遷移力，提示GRP78可能具有致癌潛能。因?yàn)椴煌[瘤細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制不盡相同，與大多數(shù)研究結(jié)果不同，Chang 等[13]研究表明，GRP78表達(dá)降低可促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，提示GRP78可能對不同類型的癌癥表現(xiàn)出促腫瘤或抑瘤作用，因此還需要進(jìn)一步研究明確GRP78在惡性腫瘤的相關(guān)調(diào)控功能。

項(xiàng)目nE-cadherinN-cadherinvimentinp-PI3Kp-Akt對照組30.48±0.070.82±0.490.68±0.070.74±0.150.72±0.04siRNA組30.75±0.70?0.61±0.22?0.57±0.13?0.54±0.04?0.46±0.05?t值22.8099.5320.7472.0059.30P值0.0090.0010.0100.0010.002

*與對照組比較P<0.05

EMT與腎癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。腎癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，上皮細(xì)胞標(biāo)記物如E-cadherin下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、vimentin上調(diào)，增加了細(xì)胞侵襲力，促進(jìn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，因此抑制EMT是一種很有前途的腎癌治療策略。為進(jìn)一步探討沉默GRP78后腎癌細(xì)胞侵襲及遷移力下降的調(diào)控機(jī)制是否與EMT 改變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)沉默GRP78下調(diào)增加了E-cadherin的表達(dá)，減少了N-cadherin和vimentin表達(dá)。本研究推測沉默GRP78后對腎癌細(xì)胞EMT起抑制作用，從而降低腎癌細(xì)胞侵襲及遷移力。而GRP78通過何種信號通路影響EMT目前研究少見。

研究證實(shí)PI3K/Akt信號通路廣泛存在細(xì)胞中，是參與細(xì)胞生長、增殖、分化的重要信號通路[15-16]，PI3K/Akt信號通路可誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞EMT[14]。本研究探討了沉默GRP78表達(dá)后對腎癌細(xì)胞PI3K和Akt激活的影響。結(jié)果表明下調(diào)GRP78可顯著降低腎癌細(xì)胞PI3K和Akt磷酸化水平。根據(jù)這些研究結(jié)果，本研究推測GRP78可能通過調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞中的PI3K/Akt信號而抑制EMT，從而影響上皮和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)，表現(xiàn)為E-cadherin上調(diào)，N-cadherin、vimentin表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響了腎癌細(xì)胞侵襲力,提示RNA干擾GRP78后可影響腎癌細(xì)胞的侵襲力。但腎癌細(xì)胞的侵襲力及EMT調(diào)控可能涉及多個信號通路及信號分子，因此需要進(jìn)一步研究明確GRP78調(diào)控腎癌細(xì)胞侵襲力的具體機(jī)制。本研究下一步擬建立惡性腫瘤的裸鼠移植模型，進(jìn)一步干擾GRP78表達(dá)后對腎癌細(xì)胞體內(nèi)的影響。

綜上所述，GRP78的下調(diào)可能抑制了EMT，進(jìn)而促進(jìn)E-cadherin 的表達(dá)，同時(shí)減少間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin 和vimentin的表達(dá)，從而抑制了腎癌細(xì)胞侵襲、克隆和遷移能力，其機(jī)制可能與GRP78調(diào)控PI3K/Akt信號通路有關(guān)，提示GRP78有可能成為腎癌基因治療的良好靶點(diǎn)和診斷標(biāo)記物。