韓鵬， 吳學舉， 楊明義， 李家勇

畢節(jié)市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科(貴州畢節(jié) 551700)

梅尼埃病是一種內(nèi)耳疾病，在醫(yī)學臨床上較為常見，目前梅尼埃病病因尚未明確，有專家提出是由于膜迷路積水造成，主要臨床癥狀表現(xiàn)為旋轉(zhuǎn)性的眩暈、聽力損傷、耳鳴、耳脹等[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，梅尼埃病可能與多種抗原具有相關(guān)性，髓鞘PO蛋白因為和周圍的神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，造成一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病。PO蛋白是一種糖蛋白，是免疫球蛋白家族中的一員，主要集中分布于哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)細胞膜以及內(nèi)耳的聽覺神經(jīng)纖維和神經(jīng)節(jié)上[3]。PO蛋白是髓鞘神經(jīng)的重要組成成分，對神經(jīng)細胞的生長和信息的傳遞有重要的促進作用，還可以結(jié)合抗體對自身免疫性耳病患者產(chǎn)生免疫反應，造成髓鞘神經(jīng)發(fā)生病變，導致疾病的發(fā)生[4]。2016年11月至2017年10月，本研究通過建立梅尼埃病模型大鼠，隨機分為模型組、培他啶組和聯(lián)合組，分別采用前庭神經(jīng)抑制劑苯海拉明和培他啶治療，分析對梅尼埃病模型大鼠治療效果及對大鼠PO蛋白抗體的影響，結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康大鼠36只，雄性，鼠齡3～6個月，平均(4.5±1.2)個月，體質(zhì)量140～250 g，平均(165.5±20.3)g。所有大鼠均飼養(yǎng)在干凈的動物籠里，室溫在(21.5±1.5)℃，相對濕度40%～45%，光照時間明12 h,暗12 h，飲用純凈水，按照常規(guī)的方法進行飼養(yǎng)1周。納入標準：所有大鼠均無用藥史；經(jīng)過耳鏡觀察雙耳的外耳道和耳膜均完整、健康；耳廓反射靈敏，沒有眼震反應。所做實驗均獲得我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 大鼠梅尼埃病模型建立 采用自身免疫法建立大鼠梅尼埃病模型。在常規(guī)免疫的基礎(chǔ)上，第1次使用0.5 mg的同種粗制內(nèi)耳抗原(ICIEAgs)，0.25 mL的加弗氏佐劑；第2次使用劑量為0.25 mg的ICIEAgs，0.25 mL的加弗氏佐劑進行強化免疫，每次的時間間隔為5 d；使用劑量為0.02 mg的ICIEAgs，0.02 mL的加弗氏佐劑進行局部淋巴囊免疫。注射采用多位置點皮下注射，分別在大鼠后足、背部和腹部進行。模型建立成功的標準為大鼠出現(xiàn)眼震、擺頭、走路不穩(wěn)、腦干聽力聽閥值下降等，滿足其中一項就算符合。

1.2.2 治療及操作 建模成功的大鼠共計30只，隨機分為模型組、培他啶組和聯(lián)合組，各10只。模型組大鼠給予常規(guī)飼養(yǎng)生理鹽水灌胃；培他啶組大鼠在模型組的基礎(chǔ)上給予培他啶治療，培他啶劑量4 mg/mL；聯(lián)合組在模型組基礎(chǔ)上給予大鼠苯海拉明聯(lián)合培他啶治療，苯海拉明劑量10 mg/mL；3組大鼠的給藥方式均為鼓膜直接注射到鼓室位置，劑量為0.1 mL，一次完成，操作均在顯微鏡下進行。

1.2.3 大鼠聽覺聽閥檢測 選擇環(huán)境在具有隔音功能的聽力室，在大鼠腹腔的位置，采用85 mg/kg水合氯醛溶液進行麻醉，之后將大鼠固定在動物的手術(shù)臺上，當大鼠進入深度麻醉時，在無菌操作下使用專用電極，刺入大鼠體內(nèi)。強度80聲壓級，頻率為10次/s,波次100～3 000 Hz,時程20 ms,將耳機固定在大鼠外耳道的0.5 cm處。

1.2.4 免疫透射比濁法檢測PO蛋白水平 將待測大鼠用乙醚麻醉后，斷頭處死，在大鼠腹部刮毛抽血2 mL，加入20倍體積的離心緩沖液，手動均漿10 min，用離心機以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速分離，取上層血漿電動勻漿后，用離心機以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速分離，取上層血漿放置-70℃的環(huán)境中凍存，待用。將待測標本放入特定蛋白分析儀中抗原抗體結(jié)合，形成復合物，經(jīng)過一定時間反應觀察濁度。采用比濁計測定光的密度值，分析PO蛋白水平。

1.2.5 化學發(fā)光分析法檢測PO蛋白抗體IgM、IgG濃度 待測標本加入化學發(fā)光物質(zhì)，與催化劑發(fā)生催化反應，與氧化劑發(fā)生氧化反應，形成處于激發(fā)狀態(tài)的中間體，當中間體達到穩(wěn)定時，會發(fā)射出光子，嚴格按照化學發(fā)光分析儀操作步驟，利用發(fā)光信號測量儀測量光子數(shù)值，對比分析IgM、IgG濃度。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法檢測血管加壓素濃度 將待測的標本和酶標物嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟與固相載體產(chǎn)生反應作用，將固相載體反應的復合物經(jīng)過洗滌與其他物質(zhì)分離，加入酶反應底物，經(jīng)過酶的催化作用形成有色物質(zhì)，根據(jù)顏色的深淺進行定性或定量分析血管加壓素濃度。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠治療前、后聽覺聽閥比較 治療前3組大鼠聽覺聽閥比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。培他啶組和聯(lián)合組兩組大鼠治療后聽覺聽閥顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后聯(lián)合組大鼠聽覺聽閥顯著低于培他啶組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

項目n聽閥治療前治療后模型組1054.22±7.93培他啶組1053.66±6.8945.69±5.25聯(lián)合組1053.78±6.6637.85±4.89F值0.575.17P值>0.05<0.05

2.2 3組大鼠治療前、后PO蛋白水平比較 治療前3組大鼠PO蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。培他啶組和聯(lián)合組兩組大鼠治療后PO蛋白水平顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后聯(lián)合組大鼠PO蛋白水平顯著低于培他啶組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 3組大鼠治療前、后PO蛋白抗體濃度比較 治療前3組大鼠PO蛋白抗體IgM、IgG濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。培他啶組和聯(lián)合組兩組大鼠治療后PO蛋白抗體IgM、IgG濃度顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后聯(lián)合組大鼠PO蛋白抗體IgM、IgG濃度顯著低于培他啶組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

項目nPO蛋白治療前治療后模型組1050.33±17.63培他啶組1050.66±16.8930.69±9.25聯(lián)合組1050.78±16.6620.85±6.89F值0.034.04P值>0.05<0.05

項目nIgMIgG治療前治療后治療前治療后模型組1037.44±14.8440.36±15.29培他啶組1036.78±13.6930.54±10.6740.02±14.8930.78±12.56聯(lián)合組1036.88±13.9620.88±10.3039.96±14.9820.66±9.89F值0.034.160.003.03P值>0.05<0.05>0.05<0.05

2.4 3組大鼠治療前、后血漿中血管加壓素濃度比較 治療前3組大鼠血漿中血管加壓素濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。培他啶組和聯(lián)合組兩組大鼠治療后血漿中血管加壓素濃度著低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后聯(lián)合組大鼠血漿中血管加壓素濃度顯著低于培他啶組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

項目n血管加壓素濃度治療前治療后模型組106.15±0.46培他啶組106.06±0.565.55±0.36聯(lián)合組106.18±0.543.81±0.54F值0.0512.71P值>0.05<0.05

3 討論

我國是中內(nèi)耳疾病的高發(fā)國家，發(fā)病率已達到4%，并且在逐年提高，嚴重損害人們的健康。梅尼埃病是臨床上最常見的一種中內(nèi)耳疾病，病理特征為膜迷路積水，臨床癥狀主要表現(xiàn)為眩暈，伴隨聽力損傷甚至消失，目前其發(fā)病的主要機制并不明確，說法不一[5-6]。目前對中內(nèi)耳疾病的治療主要是給予糖皮質(zhì)激素，但是外淋巴系統(tǒng)屏障會阻礙藥物到達中內(nèi)耳組織中，所以為了能夠達到位置，經(jīng)常會選用大劑量的藥物濃度。但是會產(chǎn)生不良反應，同時也不能給高血壓、糖尿病、胃潰瘍患者用藥，傳統(tǒng)意義上的用藥存在著一些弊端和局限性，不能更好地發(fā)揮其作用[7-8]。因此，鼓室內(nèi)局部注射用藥治療中內(nèi)耳疾成為研究的熱門，怎樣保持長時間的高劑量供藥，也是研究的重點。常規(guī)的供藥方式主要包括在鼓室直接給藥，安裝給藥裝置等，各有各的不足之處。根據(jù)張煥等[9]提出的具體要求，總結(jié)為以下幾點：要具有較好的緩釋效果，能夠長時間的供藥；局部供藥的濃度保持一致，時間長，在鼓室中能夠長時間起作用；方法要簡單便捷，減輕患者的痛苦。

本研究中，培他啶組和聯(lián)合組兩組大鼠治療后聽覺聽閥顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對選取建模成功的大鼠進行藥物治療，通過電位測定來評價大鼠的聽力狀況，說明聽力聽閥值高，大鼠聽力差，兩種藥物治療均可以降低大鼠的聽閥值。治療后聯(lián)合組大鼠聽覺聽閥顯著低于培他啶組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明前庭神經(jīng)抑制劑聯(lián)合培他啶可以改善大鼠的聽力，聯(lián)合治療優(yōu)于單用一種藥物治療。研究發(fā)現(xiàn)，PO蛋白抗體是一種髓鞘蛋白，PO蛋白抗體的基因發(fā)生變異和周圍神經(jīng)系統(tǒng)病變有聯(lián)系[10]。培他啶組和聯(lián)合組兩組大鼠治療后PO蛋白水平及其抗體IgM、IgG濃度顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后聯(lián)合組大鼠PO蛋白水平及其抗體IgM、IgG濃度顯著低于培他啶組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。血管加壓素也叫抗利尿激素是一種9肽激素，主要分泌的場所是下丘腦的視上核和核神經(jīng)細胞，被釋放的主要途徑要通過下丘腦的巨細胞的神經(jīng)細胞的軸突末端，在垂體的后葉集聚保存[11]。血管加壓素主要是通過V1、V2、V3受體亞型進行生理調(diào)控，V2受體主要是在腎臟集合小管集中分布，通過G蛋白和腺苷環(huán)化酶相互作用，當V2受體受到刺激會場所興奮，細胞內(nèi)腺苷環(huán)化酶含量會增加，加上蛋白激酶A和水通道蛋白的共同作用，會促進身體中的水分加快吸收，從而產(chǎn)生抗利尿的作用[12]。所以說滲透壓的穩(wěn)定具有重要的意義。結(jié)果顯示，培他啶組和聯(lián)合組兩組大鼠治療后血漿中血管加壓素濃度著低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后聯(lián)合組大鼠血漿中血管加壓素濃度顯著低于培他啶組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明前庭神經(jīng)抑制劑聯(lián)合培他啶可以改善大鼠血管加壓素濃度，降低其水平,這一結(jié)果與陳曉明等[13]研究保持一致。血漿中的滲透壓增加，血管加壓素濃度也會隨之增加，水的再吸收利用作用也會增加，會造成血液容量和血壓上升。研究顯示，給予大鼠連續(xù)注射1周的血管加壓素，大鼠的內(nèi)耳淋巴會形成積水，而在內(nèi)耳淋巴會形成積水的大鼠模型中，血管加壓素的濃度和梅尼埃病患者體內(nèi)的血管加壓素濃度保持一致[14-15]。當梅尼埃病患者急性發(fā)病時，患者體內(nèi)的血管加壓素的濃度會急劇上升，所以說，血管加壓素水平是引起梅尼埃病的重要原因。

綜上所述，本研究通過建立梅尼埃大鼠模型，分析前庭神經(jīng)抑制劑聯(lián)合培他啶的療效，得出前庭神經(jīng)抑制劑聯(lián)合培他啶治療大鼠梅尼埃病，可以降低PO蛋白抗體IgM、IgG濃度，改善大鼠聽力，治療效果顯著，值得在醫(yī)學臨床上做更深的研究。