汪席敏， 李慧，王安宇， 楊光勇， 王文佳， 何光志△， 田維毅， 蔡琨， 王平， 梁建東

1貴陽中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院(貴州貴陽 550002)；2遵義市中醫(yī)院內(nèi)分泌科(貴州遵義 563000)

黃連解毒湯(Huanglianjiedu decoction，HLJD)最早記載于《外臺秘要》，是清熱方藥的經(jīng)典代表方，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，其主治是三焦火毒熾盛癥。然而，HLJD由黃連、黃柏、梔子和黃芩四味均為苦寒之品所組成。據(jù)資料報道許多苦寒中藥對胃腸道具有刺激性，對胃腸道黏膜功能和激素水平會產(chǎn)生不同程度的影響[1]，那么苦寒中藥在臨床應(yīng)用上會不會引起宿主代謝組的改變？本次研究從2017年9月著手探討研究方案并于2018年2月完成實驗部分，擬采用高中低劑量HLJD干預(yù)實驗動物SD大鼠后觀察其糞便脂肪酸代謝的影響進行探討，考證“苦寒傷胃”之說，為評價HLJD的臨床合理應(yīng)用等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備與試劑 健康SPF級SD大鼠120只，雄雌各半，體重105～116 g，購自重慶騰鑫有限公司[動物合格證SCXK(軍)2012-0011]提供；電子秤；震蕩儀；臺式離心機(TGL-16G上海安亭科學儀器公司)；氣質(zhì)聯(lián)色譜儀(型號：GCMS-QP2010C)，日本島津公司；色譜柱：RTX-WAX柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；黃連、黃芩、黃柏和梔子，購自北京同仁堂藥店(貴陽分店)。標準品L-乳酸(批號：A19J8L40142)，標準品異丁酸(批號Z18D6H7816)，標準品戊酸(批號：Z13A8H33669)，標準品異戊酸(批號：F22N7E25082)和標準品萘(批號：Q21J8C38350)均購自上海源葉生物科技有限公司；色譜甲醇(批號：20101127)，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HLJD水煎液制備 HLJD按照相關(guān)的文獻[2]取成人用藥劑量，黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g和梔子9 g，加入200 mL純水浸泡30 min，加熱至沸騰后保持1 h，以4層無菌紗布過濾出藥液，藥渣再次加入150 mL純水，加熱沸騰后繼續(xù)保持1 h，以4層無菌紗布過濾藥液，然后合并2次煎液，濃縮調(diào)整濃度為0.086 g/mL。

1.2.2 動物分組 將120只SD大鼠隨機分為5組，每組24只，將SD大鼠分為HLJD高劑量組、HLJD中劑量組、HLJD低劑量組、空白組和抗生素組。其中HLJD中劑量組為成人用量30 g/70 kg換算而來，體重計算為4.29 g/kg[3]，HLJD高劑量組為中劑量組的2倍用量，HLJD低劑量組是HLJD中劑量組的1/2用量?？股亟M參照張文娣[4]使用劑量進行，其鏈霉素、氨芐西林、克林霉素按照2∶1∶1.8比例調(diào)配。空白組則是灌胃相同體積的蒸餾水。各組灌胃濃度與體積見表1。

表1 各組大鼠灌胃濃度

1.2.3 臨床腹瀉觀察 各組分別用相應(yīng)藥物進行灌胃后，每天臨床觀察腹瀉情況。

1.2.4 實驗動物糞便中脂肪酸含量的檢測

1.2.4.1 樣本采集 分別于實驗動物灌14 d后收集的糞便混合，置于1.5 mL無菌EP管內(nèi)，再存放于-80℃冰箱中保存。稱取糞便樣品0.1 g于1.5 mL離心管中；加入400 mL乙醇浸泡12 h，置于4℃離心機內(nèi)以12 000 r/min離心15 min，取上清200 μL于0.22 μm有機濾膜濾過即得糞便樣本。以GC-MS法完成各大鼠糞便樣本中乳酸、異丁酸、異戊酸、戊酸和萘的濃度測定。

1.2.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法檢測糞便脂肪酸含量 參照相關(guān)文獻方法進行GC-MS[5]。GC：取上述經(jīng)前處理的樣品1 μL，測定條件為氣相色譜：載氣為氦氣，流速為1.06 mL/min，用30 m×0.25 mm的RTX-WAX為色譜柱，采用程序升溫的方法，起始溫度40℃，持續(xù)1 min，以18℃/min升溫至180℃，再以20℃/min升至240℃，保持5 min，進樣口溫度230℃，傳輸線溫度為240℃，運行時間為12.5 min。MS：掃描范圍20～200 m/z，掃描模式：SIM。監(jiān)測離子：乳酸(L-Lactic acid)45 m/z，異丁酸(isobutyric acid)73 m/z，戊酸(pentanoic acid)60 m/z，異戊酸(isopentanoic acid)60 m/z，萘(naphthalene)128 m/z，離子源溫度200℃，EI源轟擊能70 eV。各樣本檢測均設(shè)定2個平行樣本，各個平行樣本均檢測2次。試驗采用出峰保留值比較法完成大鼠糞便代謝物中乳酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和萘的定性分析。用出峰面積結(jié)合外標一點法完成大鼠糞便中乳酸、異丁酸、異戊酸、戊酸與萘的定量分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床腹瀉觀察 HLJD中、低劑量組和空白組SD大鼠精神和食欲及大小便形態(tài)正常?？股亟M和HLJD高劑量組大鼠5 d后逐漸出現(xiàn)腹瀉、被毛粗亂無光澤、糞便不成形，隨著時間延長逐漸行動緩慢、飲食逐漸下降、糞便稀，而且腹瀉加重個體出現(xiàn)精神極差和形體消瘦等癥狀。

2.2 各組動物糞便中乳酸、異丁酸、異戊酸、戊酸和萘含量的影響 與空白組比較，HLJD高劑量組和抗生素組糞便中乳酸、異丁酸、異戊酸、戊酸、萘含量呈顯著性降低(P<0.05)，HLJD中劑量組樣本異戊酸、戊酸、萘呈顯著性降低(P<0.05)；與HLJD低劑量組比較，HLJD高劑量組和抗生素組實驗動物中乳酸、異丁酸、異戊酸、戊酸和萘含量呈顯著性降低(P<0.05)，HLJD中劑量組異戊酸和戊酸含量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2及圖1。

組別乳酸異丁酸異戊酸戊酸萘抗生素組0.030±0.003?△0.124±0.016?△0.000 11±0.000 02?△ 0.000 21±0.000 03?△ 0.021±0.003?△HLJD高劑量組0.326±0.005?△0.206±0.024?△0.000 22±0.000 03?△0.000 31±0.000 02?△0.035±0.003?△HLJD中劑量組0.046±0.0040.496±0.0600.000 37±0.000 04?△0.000 36±0.000 04△0.036±0.005?HLJD低劑量組0.458±0.0080.554±0.0910.001 19±0.000 300.000 61±0.000 040.043±0.005空白組0.994±0.0111.574±0.106△0.003 28±0.000 390.000 95±0.000 050.151±0.020

*與空白組比較P<0.05；△與HLJD低劑量組比較P<0.05

A：對照品；B：空白組；C：HLJD低劑量組；D：HLJD中劑量組；E：HLJD高劑量組；F：抗生素組；1：乳酸；2：異丁酸；3：異戊酸；4：戊酸；5：萘

3 討論

本研究采用高中低劑量的HLJD對SD大鼠進行灌胃，在14 d后采集糞便樣本，運用GC-MS對樣本中糞便中脂肪酸乳酸、異丁酸、異戊酸、戊酸、萘的含量進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量HLJD與抗生素組實驗動物糞便中乳酸、異丁酸、異戊酸、戊酸、萘含量發(fā)生明顯降低(P<0.05)，結(jié)果提示高劑量HLJD和抗生素都會引起宿主脂肪酸代謝發(fā)生明顯改變。從實驗結(jié)果來推測，高劑量的HLJD可能有抗生素樣作用，因此引起高劑量組大鼠有與抗生素組大鼠相似的癥狀。而中劑量HLJD組大鼠在實驗結(jié)果中并未出現(xiàn)與抗生素組大鼠腹瀉等類似的癥狀，與實驗數(shù)據(jù)分析中存在自相矛盾的狀況，這是本研究中存在的一個尚不明確的盲點，猜想或許是在HLJD高劑量組和中劑量組的用藥劑量中存在某個閾值，超出這個值則大鼠呈現(xiàn)與抗生素相類似的癥狀。這個閾值將成為進一步研究探討的方向，值得深度剖析解答。

現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)HLJD在一定程度上影響腸道菌群分布，從而對于小鼠脂肪酸代謝產(chǎn)生影響[6-7]。代謝組學是通過對于內(nèi)源性代謝物圖譜的信息分析，來評價藥物安全性的可行方法，可以精準發(fā)現(xiàn)藥物的使用結(jié)果及其規(guī)律[8-9]。糞便代謝組被認為是腸道菌群代謝與宿主代謝組成的共同代謝[10]。據(jù)報道乳酸濃度的變化一定程度上反映出腸道內(nèi)乳酸桿菌群的數(shù)量變化[11]。而異丁酸、萘的濃度主要與理研菌科、瘤胃球菌科呈正相關(guān)，戊酸、異戊酸的濃度則主要與毛螺旋菌科、消化球菌科呈正相關(guān)[12]。

HLJD由黃連、黃柏、黃芩和梔子四味苦寒中藥組成?！翱嗪畟浮敝f也一直為歷代醫(yī)藥學家所關(guān)注。羅海華等[13]發(fā)現(xiàn)，采用高劑量苦寒方藥HLJD會引起小鼠腸道菌群失調(diào)，有類似濫用抗生素的破壞作用。在本研究中，抗生素能改變實驗動物糞便脂肪酸代謝，抗生素性味苦寒，與中醫(yī)苦寒中藥有相似之處?？股氐臑E用能導致胃腸道菌群失調(diào)，一些抗生素常常用于腸道菌群失調(diào)的動物模型的制備[14-15]。本研究重點在于把成分較為單一且藥物作用機制相對清楚的抗生素作為參比，來推敲藥物有效成分較為復(fù)雜且作用機制尚不明確的方藥HLJD的合理使用，為探討現(xiàn)有眾多方藥的研究提供一定的依據(jù)。

綜上所述，高劑量HLJD導致宿主胃腸道微生態(tài)失調(diào)，體內(nèi)相應(yīng)的代謝過程和代謝產(chǎn)物也隨之發(fā)生改變，這可能是高劑量HLJD導致宿主脂肪酸代謝明顯降低的可能原因。本研究結(jié)果為評價HLJD的臨床合理應(yīng)用等提供科學依據(jù)，并為進一步探索HLJD胃腸道菌群結(jié)構(gòu)-代謝組的藥理毒理評估模式積累研究基礎(chǔ)。