鄭巧靈， 張建勇， 張文雄， 梁永剛， 喻東亮， 魏益平， 徐建軍

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸心外科(江西南昌 330008)

肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其病死率均居惡性腫瘤首位[1-2]。有研究表明I～I(xiàn)I期肺癌患者的5年生存率明顯高于Ⅲ～Ⅳ期，但由于大約65%肺癌患者確診是已經(jīng)為晚期，這部分患者的5年生存率僅為5%左右，從而導(dǎo)致肺癌的總體5年生存率約為10%～18%[3]。因此，提高肺癌的早期診斷率是改善肺癌預(yù)后的關(guān)鍵。目前臨床上，肺癌早期診斷仍以傳統(tǒng)的X線、細(xì)胞CT、痰脫落細(xì)胞及支氣管鏡等方法為主，近年來，肺癌的早期診斷在影像學(xué)、支氣管鏡檢查和分子標(biāo)志物檢測等方面取得了一定的進(jìn)展，但有研究表明，目前主流的肺癌早期篩查方法應(yīng)用于肺癌的篩查并不能降低肺癌的病死率[4]。痰液中含有與肺部疾病相關(guān)的分子信息，在大部分肺部疾病中，如肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺炎及肺癌等，痰液檢測是診斷或鑒別這些疾病非常有效的的方法[5]。但目前由于敏感度低、可重復(fù)性差等缺點(diǎn)，痰液檢測在臨床中肺癌診斷和篩查方面的運(yùn)用受到了極大的限制[6]。因此，開發(fā)一種敏感度高、特異度強(qiáng)、可重復(fù)的肺癌篩查新方法顯得尤為重要。質(zhì)譜分析(MS)技術(shù)是一種敏感度高、特異度好、響應(yīng)速度快的現(xiàn)代分析測試技術(shù)[7]。中性解吸電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(ND-EESI-MS)方法是適用于黏稠的復(fù)雜基質(zhì)，已運(yùn)用于蜂蜜、牙膏及化妝品等黏稠物的分析[8]。本研究運(yùn)用ND-EESI-MS耦合最小偏二乘法(PLS)鑒別肺癌痰液及非肺癌痰液。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會認(rèn)證，連續(xù)收集2016年1—6月同一治療組符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者，肺部疾病患者留痰液標(biāo)本前未使用任何藥物；每例患者留取痰樣前空腹8 h以上；取樣時先用生理鹽水漱口2次；留取患者晨起第一口深部痰，所留取痰樣置于-80℃保存。入選患者根據(jù)手術(shù)后病理結(jié)果分為肺癌組和對照組，其中肺癌組67例，年齡41～78歲，其中鱗癌27例、腺癌35例、5例腺鱗癌。對照組(良性肺疾病及健康者痰液)43例，年齡24～75歲，其中肺炎5例、支氣管擴(kuò)張的13例、9例慢性阻塞性肺疾病及健康人16例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺癌組，以肺癌診斷入院，留取入院次日痰液，手術(shù)中病理確診為肺癌。(2)對照組(良性肺疾病及健康者痰液)，手術(shù)病理為肺部良性疾病患者或排外惡性腫瘤患者及健康對照組，生理鹽水漱口后留取晨起第一口深部痰。

1.2 材料 ND-EESI離子源(ZL201610079585.X)[9]；LTQ-XL增強(qiáng)型線性離子阱質(zhì)譜儀，配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Finnigan公司)；KQ3200型超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。甲醇(色譜純, 美國Fisher Scientific公司)；醋酸 (分析純 上海試劑化學(xué)有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為2次去離子水。

1.3 ND-EESI-MS分析 痰液的ND-EESI-MS分析方法：痰液樣品未經(jīng)任何處理，解凍后直接置于樣品管中進(jìn)行分析。設(shè)置ND-EESI離子源為正離子模式，質(zhì)量范圍50～500 Da；離子傳輸管溫度150℃；噴霧電壓3.5 kv；透鏡電壓60.00 v；電噴霧氮?dú)鈮毫?.4～0.6 Mpa，解吸氮?dú)鈮毫?.2 Mpa，其他條件系統(tǒng)自動優(yōu)化，具體參數(shù)細(xì)節(jié)示意圖(圖1)。

萃取液在電噴霧氣體和高電壓作用下霧化并發(fā)生電離產(chǎn)生“帶電霧滴”。痰液樣本在中性解吸裝置中(圖示左下部分)高壓解吸氣體的作用下，解吸出痰樣中的中性有形成分，經(jīng)進(jìn)樣噴頭到達(dá)“電噴霧萃取區(qū)”與其中的“帶電霧滴”混合，發(fā)生實(shí)時“液-液微萃取”和電離，從而使樣本中解吸出來的中性分子形成帶電微粒進(jìn)入質(zhì)譜儀中檢測質(zhì)荷比(m/z)得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖1 ND-EESI-MS示意圖

1.4 ND-EESI-MS指紋譜圖的PLS分析及相對豐度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將ND-EESI-MS所記錄的痰液樣品的質(zhì)譜指紋譜圖的相對豐度數(shù)據(jù)導(dǎo)出，并將數(shù)據(jù)整理為每行代表1個樣本，每列代表1個質(zhì)荷比(m/z)值的矩陣X。用Matlab Toolbox進(jìn)行PLS分析結(jié)果，上述數(shù)據(jù)處理方法均在Matlab7.8中編程實(shí)現(xiàn)。離子的相對豐度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均在SPSS 21.0 中完成。

2 結(jié)果

2.1 痰液ND-EESI-MS質(zhì)譜指紋圖譜 采用ND-EESI-MS技術(shù)，在正離子模式下，通過實(shí)驗(yàn)?zāi)艿玫椒伟┱咛狄?、良性肺疾病者痰液及健康者痰液樣品的一級質(zhì)譜指紋圖譜，通過對比發(fā)現(xiàn)，良性肺疾病者痰液與健康者痰液樣本一級質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)無明顯差異，故將良性肺疾病者痰液與健康者痰液定義為對照組，與肺癌者痰液樣本進(jìn)對比分析，通過比較兩組痰液樣品的指紋圖譜，可見兩組樣本指紋圖譜在m/z99.99，m/z115.00，m/z171.83，m/z207.97，m/z250.81，m/z274.39， m/z278.87，m/z318.37，m/z346.30，m/z348.10，m/z374.37，m/z376.15，m/z390.42等處的質(zhì)譜峰的信號強(qiáng)度有較明顯的差異。見圖2。

A：肺癌組痰液，質(zhì)譜指紋離子以m/z115.00，m/z250.81，m/z274.39，m/z278.87，m/z318.37，m/z348.04，m/z376.15，m/z390.42為主；B：對照組痰液，質(zhì)譜指紋主要離子為m/z99.99，m/z115.00，m/z171.83，m/z207.97，m/z274.23，m/z278.98，m/z318.26，m/z346.30，m/z348.10，m/z374.37，m/z390.34等。

圖2肺癌痰液及對照組痰液一級質(zhì)譜指紋圖譜

2.2 痰液ND-EESI-MS質(zhì)譜指紋PLS分析結(jié)果 將肺癌組與對照組(肺良性疾病組及健康組)痰液ND-EESI-MS質(zhì)譜指紋圖譜進(jìn)行PLS分析，發(fā)現(xiàn)兩組樣本一級質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)能夠明顯區(qū)分(圖3-A、B、C)，根據(jù)對區(qū)分的離子貢獻(xiàn)結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)其中主要的差異性物質(zhì)是m/z238、m/z251、m/z274、m/z279、m/z348、m/z374、m/z379和 m/z391之間的相對豐度差異最為明顯，見圖3-D。

2.3 比較兩組樣本中差異性離子的相對豐度 對PLS分析發(fā)現(xiàn)的差異性離子相對豐度進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)m/z238、m/z279、m/z348及m/z379在肺癌患者痰液中的相對豐度明顯高于對照組痰液(均P<0.05)，而m/z251及m/z391在肺癌患者痰液中的相對豐度明顯低于對照組痰液(均P<0.05)。m/z274及m/z374的相對豐度在兩組痰液樣本中無明顯差異(均P>0.05)。見表1、圖4。

3 討論

肺癌是我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，早期肺癌患者生存率明顯優(yōu)于中晚期患者，但目前2/3左右患者診斷時已為晚期，提高早期診斷率是目前急需解決的問題[1]。目前肺癌的診斷方法主要是傳統(tǒng)的X線、胸部CT、血液檢驗(yàn)、痰脫落細(xì)胞及支氣管鏡等方法，但這些方法或多或少存在一定缺陷，如影像學(xué)檢查有輻射、血液檢查及支氣管鏡因?yàn)橛袆?chuàng)性而難以被人們接受，而痰液脫落細(xì)胞則因?yàn)槊舾行缘投鵁o法推廣，且有研究表明，傳統(tǒng)的肺癌診斷方法因依從性差對降低肺癌病死率貢獻(xiàn)有限[4]。痰液及呼出氣體都是無創(chuàng)診斷肺部疾病的理想樣本，但呼出氣體存在不易收集及運(yùn)輸?shù)娜秉c(diǎn)，因而在無創(chuàng)診斷肺部疾病方面，痰液具有巨大優(yōu)勢因痰液富含與肺部疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物學(xué)信息，但由于敏感度低、可重復(fù)性差等缺點(diǎn)，痰液在肺癌診斷和篩查方面的臨床運(yùn)用受到了極大的限制[6,10-11]。

A：在LS1及LS2上的2D模式 PLS結(jié)果；B：在LS1及LS3上的2D模式 PLS結(jié)果； C：3D模式 PLS結(jié)果；D：主要差異性物質(zhì)載荷圖

離子肺癌組對照組P值m/z2380.73±0.4250.22±0.143<0.05m/z2794.44±1.0403.36±1.425<0.05m/z3489.64±1.5773.73±1.494<0.05m/z3790.73±0.4250.22±0.143<0.05m/z2512.10±1.6145.07±3.148<0.05m/z3914.06±1.9928.88±1.746<0.05m/z2742.47±0.9862.26±1.396>0.05m/z3740.04±0.0990.08±0.174>0.05

兩組比較*P<0.05

質(zhì)譜分析(MS)技術(shù)是一種敏感度高、特異度好、響應(yīng)速度快的現(xiàn)代分析測試技術(shù)。質(zhì)譜分析技術(shù)是主要是利用電場和磁場控制帶電粒子的運(yùn)動軌跡，并能根據(jù)粒子的質(zhì)量及帶電量將不同的帶電粒子區(qū)分開(即質(zhì)量與帶電量比值相等的粒子會到達(dá)同一檢測區(qū)域)，然后檢測器能夠獲取粒子信息，從而獲得帶電粒子質(zhì)譜指紋圖譜。根據(jù)質(zhì)譜指紋圖譜的結(jié)果，可以分析出物質(zhì)的質(zhì)核比信息從而實(shí)現(xiàn)對待測物中某些粒子的定性與定量分析，已廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的診斷、分子標(biāo)志物檢測等領(lǐng)域。ND-EESI-MS[12]能夠運(yùn)用于黏稠液體的直接分析，已成功運(yùn)用于牙膏、蜂蜜、化妝品等黏稠液體的分析。前期研究發(fā)現(xiàn)ND-EESI-MS能夠?qū)μ狄哼M(jìn)行直接分析并得到其內(nèi)部的分子生物學(xué)信息[10]，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，對肺癌患者痰液及對照組痰液進(jìn)行直接分析，以期發(fā)現(xiàn)肺癌痰液中與肺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子生物學(xué)信息。

應(yīng)用ND-EESI-MS技術(shù)耦合PLS分析能夠明顯去區(qū)分兩組樣本一級質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)，且發(fā)現(xiàn)離子m/z238、m/z251、m/z274、m/z279、m/z348、m/z374、m/z379和 m/z391對區(qū)分兩組樣本的貢獻(xiàn)較大。對比發(fā)現(xiàn)離子m/z238、m/z279、m/z348及m/z379在肺癌組痰液中的相對豐度明顯高于對照組痰液，而離子m/z251及m/z391在對照組痰液中明顯高于肺癌患者痰液，離子m/z274及m/z374的相對豐度在兩組痰液樣本中無明顯差異。

運(yùn)用ND-EESI-MS技術(shù)耦合PLS分析方法可以良好區(qū)分肺癌痰液與對照組痰液質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)并識別對區(qū)分貢獻(xiàn)度大的差異性離子，可作為肺癌痰液鑒別的新方法，以期能在未來用于肺癌的診斷或篩查。但本研究僅找出差異性離子且樣本量不是非常大，差異性離子的分子結(jié)構(gòu)及差異性離子的生物學(xué)意義仍需進(jìn)一步研究。