秦 起， 李 芮， 曾慶繁

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 麻醉學(xué)院, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院， 貴州 貴陽 550004)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是老年患者麻醉手術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為精神異常、人格改變及學(xué)習(xí)記憶能力減退，嚴(yán)重影響了患者預(yù)后、降低患者生活質(zhì)量。POCD發(fā)生的機(jī)制目前尚不清楚，研究認(rèn)為麻醉及手術(shù)誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是引起POCD的重要原因[1-2]。隨著人口老齡化及醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，大量的老年人接受麻醉手術(shù)，臨床POCD的發(fā)生率明顯增加，POCD的預(yù)防和治療顯得尤為重要。白藜蘆醇是從植物中提取的天然化學(xué)物質(zhì)，具有抗炎作用，其改善認(rèn)知功能的作用日益受到重視[3-4]。本研究擬通過觀察白藜蘆醇對老年大鼠七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)術(shù)后認(rèn)知功能及海馬組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的影響，為臨床POCD的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

七氟醚(批號79111，美國艾伯維公司)，白藜蘆醇(北京索萊寶科技有限公司)，丙二醛(MDA)試劑盒, 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，活性氧(ROS)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(上海欣博盛科技有限公司)。麻醉呼吸機(jī)及麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，Morris水迷宮儀(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實驗室提供)

1.2 實驗動物分組與處理

16～18月齡的健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量550～600 g[貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供和飼養(yǎng)，許可證號為SCXK(黔)2018-0001]，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成對照組、麻醉手術(shù)組和白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組,每組12只。白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組麻醉手術(shù)前連續(xù)7 d給予白藜蘆醇100 mg/kg灌胃，對照組及麻醉手術(shù)組給入等容量的1%羥甲基纖維素鈉溶液灌胃。

1.3 動物麻醉及手術(shù)

將需要麻醉的麻醉手術(shù)組及白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組老年大鼠置于透明的密閉塑料麻醉箱(50 cm×30 cm×30 cm)，箱底鋪一層鈉石灰,將取暖器置于箱旁60 cm，維持鼠體溫36～37 ℃,麻醉機(jī)調(diào)整為手控模式,從進(jìn)氣口吸入3%的七氟醚和2 L/min的氧氣 ,出氣口接麻醉氣體監(jiān)測儀和廢氣回收罐[5-6]。檢測出氣口七氟醚及CO2濃度,麻醉箱七氟醚濃度穩(wěn)定在3%后放入手術(shù)大鼠,待大鼠翻正反射消失后將大鼠置入連接麻醉箱的麻醉面罩內(nèi)繼續(xù)麻醉并進(jìn)行剖腹探查手術(shù)；固定大鼠四肢，剪除腹部手術(shù)區(qū)毛發(fā),碘伏消毒3遍,布比卡因局部浸潤麻醉后正中切開皮膚,切口長約4～5 cm,暴露腹白線,沿著腹白線用剪刀把腹膜剪開進(jìn)入腹腔,用鑷子依次探查腹腔臟器,探查完成后用手術(shù)縫合線縫合腹膜和皮膚,手術(shù)結(jié)束后使用利多乳膏涂抹手術(shù)傷口鎮(zhèn)痛,術(shù)后把大鼠放回麻醉箱繼續(xù)麻醉。整個麻醉手術(shù)時間為2 h，麻醉過程中保持自主呼吸,密切觀察監(jiān)護(hù)儀的血氧飽和度及鼠皮膚顏色及呼吸幅度，麻醉結(jié)束后待大鼠自然清醒后放回鼠籠中。對照組大鼠不予麻醉和手術(shù)，僅吸入2 L/min的氧氣2 h。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1海馬組織ROS的測定 將大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后斷頭處死，迅速在冰上剝離海馬組織,制成單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞后BCA法測定蛋白濃度；將收集的細(xì)胞加入含有10 μmol/L的DCFH-DA無血清培養(yǎng)液中,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱撫育20 min，采用熒光酶標(biāo)儀檢測各組大鼠海馬組織ROS的熒光強(qiáng)度，結(jié)果以1 mg蛋白的熒光強(qiáng)度(RFU)來表示。

1.4.2海馬組織MDA、SOD含量的測定 采用TBA法測MDA的含量，WST-1法測SOD的含量。于-80 ℃冰箱取出新鮮海馬組織標(biāo)本，剪碎后加適量PBS(100 mg組織加0.9 mL)，超聲破碎儀破碎海馬組織，12 000 r/min離心10 min，取上清BCA法測定蛋白濃度，分別置于96孔板，用酶標(biāo)儀檢測，通過稀釋倍數(shù)和組織的蛋白濃度計算海馬MDA、SOD含量。

1.4.3海馬組織TNF-α、IL-1β的含量 取蛋白定量后的海馬組織勻漿上清，用ELISA試劑盒測定大鼠海馬TNF-α和IL-1β含量。用酶標(biāo)儀測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中TNF-α、IL-1β的濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)和組織的蛋白濃度計算海馬TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.4大鼠認(rèn)知功能Morris水迷宮試驗 術(shù)后第1天開始定向航行試驗測逃避潛伏期，每組各取6只大鼠,每天訓(xùn)練1次(包括4個象限),每個象限60 s,連續(xù)5 d。潛伏平臺放在第IV象限內(nèi),訓(xùn)練時依次從4個象限的同一點將大鼠放入水中,大鼠從入水到找到潛伏平臺時間為本次逃逸潛伏期(escape latency),大鼠找到潛伏平臺后讓其在上面停留15 s ,如果大鼠在60 s內(nèi)未找到潛伏平臺則人為將其引導(dǎo)上潛伏平臺停留15 s,每天4個象限逃逸潛伏期平均值作為當(dāng)天逃逸潛伏期，連續(xù)測試5 d。在術(shù)后第6天開始空間探索實驗測試目標(biāo)象限活動時間,將潛伏平臺移開,選定第II象限同一點為入水點,記錄大鼠60 s內(nèi)穿過目標(biāo)象限活動時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 海馬組織ROS、MDA及SOD含量

與對照組比較,麻醉手術(shù)組ROS、MDA含量顯著增加，SOD含量顯著下降；與麻醉手術(shù)組比較，白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組ROS、MDA的含量顯著下降，SOD含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 海馬組織TNF-α及IL-1β的含量

與對照組比較,麻醉手術(shù)組TNF-α、IL-1β的含量顯著增加；與麻醉手術(shù)組比較，白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組TNF-α、IL-1β的含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠海馬組織ROS、MDA、SOD及TNF-a及IL-1β含量 Tab.1 The content of ROS，MDA，SOD ，TNF-a, IL-1β in the brain tissue of rats in each groups

(1)與對照組比較,P<0.05；(2)與麻醉手術(shù)組比較,P<0.05

2.3 大鼠認(rèn)知功能測試

與對照組比較，麻醉手術(shù)組3～5 d時逃避潛伏期明顯延長，目標(biāo)象限活動時間明顯縮短；與麻醉手術(shù)組比較，白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組3～5 d時逃避潛伏期明顯縮短，目標(biāo)象限活動時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

七氟醚對人體的呼吸及循環(huán)系統(tǒng)影響較小，麻醉給藥起效快、術(shù)中維持良好、術(shù)后蘇醒快，常用于老年患者麻醉的誘導(dǎo)及維持，但是近年來關(guān)于七氟醚麻醉可能引起術(shù)后POCD的研究越來越引起重視[7-8]。POCD在臨床主要表現(xiàn)為精神異常、人格改變及學(xué)習(xí)記憶能力減退等，研究表明POCD的發(fā)生與患者年齡、麻醉、手術(shù)、術(shù)前合并癥、基礎(chǔ)認(rèn)知能力、良好教育及基因差異等多種因素有關(guān)，常發(fā)生在腹部、心臟等大手術(shù)術(shù)后[9-10]。本試驗以老年大鼠為研究對象，采用七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)來模擬臨床老年患者麻醉手術(shù)過程，術(shù)后24 h后通過Morris水迷宮試驗檢測評價處理因素對大鼠認(rèn)知功能的影響。試驗結(jié)果顯示與比對照組相比，麻醉手術(shù)組老年大鼠術(shù)后第3～5天的逃避潛伏期明顯延長，目標(biāo)象限活動時間明顯縮短，實驗結(jié)果說明老年大鼠七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)術(shù)后出現(xiàn)了早期認(rèn)知功能障礙。文獻(xiàn)報道白藜蘆醇100 mg/kg灌胃可以緩解小鼠異氟醚麻醉后的認(rèn)知減退[11]。本次試驗采用此試驗方案，每天給入100 mg/kg的白藜蘆醇，連續(xù)灌胃7 d，結(jié)果顯示,與麻醉手術(shù)組相比，白藜蘆醇+麻醉手術(shù)組老年大鼠第3～5天時逃避潛伏期明顯縮短，探索時間延長，說明上述試驗劑量的白藜蘆醇灌胃對老年大鼠七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)POCD產(chǎn)生了保護(hù)作用。

表2 3組大鼠Morris水迷宮測試結(jié)果Tab.2 Comparison of Morris water maze test in each group

(1)與對照組比較,P<0.05；(2)與麻醉手術(shù)組比較,P<0.05

POCD發(fā)生的確切機(jī)制目前尚不清楚，大量的研究認(rèn)為是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老的基礎(chǔ)上由麻醉和手術(shù)刺激誘發(fā)，多種因素綜合作用的結(jié)果，而氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)在其中扮演重要作用[12]。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，麻醉和手術(shù)誘發(fā)的強(qiáng)烈而持續(xù)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)會造成海馬損傷，影響學(xué)習(xí)記憶能力，從而誘發(fā)POCD[13]。在試驗中，麻醉手術(shù)組老年大鼠海馬組織的ROS、MDA、TNF-a、IL-1β含量明顯增加，SOD含量明顯下降，說明氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)在誘發(fā)POCD的作用中確實起著重要作用，與上述的研究結(jié)論一致。進(jìn)一步的研究表明，麻醉后脾切除的大鼠發(fā)生POCD與促炎介質(zhì)的合成增多有關(guān)，減輕促炎介質(zhì)的釋放是防治術(shù)后POCD的關(guān)鍵[14]。白藜蘆醇廣泛存在于自然界的植物中,具有抗氧化應(yīng)激、抗感染、調(diào)節(jié)糖脂代謝、神經(jīng)保護(hù)、延緩衰老等多種作用。李浩等[15]研究表明白藜蘆醇對肥胖大鼠異氟醚麻醉后的認(rèn)知功能有明顯保護(hù)作用。有研究認(rèn)為術(shù)前單次給入白藜蘆醇并沒有保護(hù)作用，而給入載有白藜蘆醇的納米乳劑可降低手術(shù)后TNF-a、IL-1β含量，改善術(shù)后認(rèn)知[16]。在本實驗中，經(jīng)過7 d白藜蘆醇灌胃處理后老年大鼠海馬組織ROS、MDA含量明顯降低，SOD含量明顯增加，TNF-a、IL-1β含量明顯降低，說明實驗中的白藜蘆醇劑量可以降低老年大鼠麻醉術(shù)后海馬組織的氧化應(yīng)激及炎癥水平，對老年大鼠的認(rèn)知產(chǎn)生了保護(hù)作用。

綜上所述，白藜蘆醇灌胃后通過降低老年大鼠七氟醚麻醉加剖腹探查術(shù)術(shù)后海馬組織的氧化應(yīng)激及炎癥水平，對認(rèn)知有保護(hù)作用。由于白藜蘆醇來源廣泛，副作用少，作用機(jī)制明確,是SIRT1受體最強(qiáng)激活劑[17]，具有有廣泛的應(yīng)用前景，接下來的試驗有必要對白藜蘆醇的安全劑量及可能的機(jī)制做更進(jìn)一步研究探討，為臨床麻醉術(shù)后POCD的預(yù)防和治療提供新策略。