嚴(yán)芝強(qiáng), 楊 芳

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004)

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)排名第4位，死亡率為癌癥死因的第2位[1]。根據(jù)全國腫瘤登記中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2015年中國胃癌發(fā)病例數(shù)約為67.9萬，死亡例數(shù)約為49.8萬，其發(fā)病率和死亡率都僅次于肺癌而排第2位[2]。隨著對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)生是由多因素作用、多基因調(diào)控、多步驟參與的復(fù)雜過程[3]。纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)g)是一種肝細(xì)胞合成和分泌的血漿糖蛋白，其在促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展方面的作用已經(jīng)得到普遍的認(rèn)可[4]。Fg主要是作為凝血因子Ⅰ而直接參與凝血過程，促進(jìn)血栓的形成。惡性腫瘤與凝血功能的改變有密切的關(guān)系，腫瘤細(xì)胞通過組織因子或其他促凝因子激活Fg，鱗狀細(xì)胞癌能刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生大量的Fg，同時(shí)Fg可分解形成纖維蛋白，為癌細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移提供支架，F(xiàn)g亦可以作為不同的黏附分子的配體，增加血小板(platelet，PLT)及腫瘤細(xì)胞間的黏附結(jié)合，PLT附著腫瘤細(xì)胞的表面，形成瘤栓阻礙免疫細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞[5-6]。因此Fg對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移具有重要的價(jià)值。編碼β鏈的基因被認(rèn)為是影響血漿Fg水平的主要基因，目前的研究大多集中于FgB基因的多態(tài)性分析上[7]。但對(duì)FgBβ鏈的基因多態(tài)性位點(diǎn)3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)的Hinf IA/ C位點(diǎn)的臨床研究較少[8]。因此,本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對(duì)FgBβ-HinfⅠA/ C位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行研究，討基因多態(tài)性與胃癌的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

以2013年6月～2015年2月經(jīng)胃鏡和病理活檢確診151例胃癌患者為研究對(duì)象，其中男89例、女62例，26～85歲、平均67歲；Ⅰ期36例、Ⅱ期29例、Ⅲ期72例、Ⅳ期13例。以同期151例健康體檢者為對(duì)照組，其中男91例、女60例， 29～86歲、平均64歲。胃癌組與對(duì)照組之間年齡、性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑和儀器

Taq DNA 聚合酶上海Sangon生物工程公司，引物合成及Maker(北京天根生化科技有限公司)，瓊脂糖(西班牙BIOWEST公司)，主要儀器PE9700擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，DNA成像分析器GelDocEQ(美國Bio-Rad公司)，DYY-III-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，恒溫水浴箱(北京長源儀器廠)，TGL-16高速離心機(jī)(常州國華電子設(shè)備公司)。

1.3 方法

1.3.1提取DNA 收集胃癌患者及對(duì)照組清晨空腹全血(EDTA-K2抗凝)各151例，白細(xì)胞層采用酚-氯仿法提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2Fgβ- HinfIA/C位點(diǎn)檢測 應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)Fgβ- HinfIA/C位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。引物序列設(shè)計(jì)參照元小冬等[10]方法。PCR反應(yīng)體系，DNA模板1 μL,特異性引物1 μL，上、下游引物1 μL，2×HotstartTaq PCR Master Mix13μL，補(bǔ)ddH2O 9 μL至25 μL。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性60 s、54 ℃退火55 s、72 ℃延伸60 s,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),最后72 ℃再延伸5 min。取PCR產(chǎn)物8 μL，加內(nèi)切酶AvaⅡ/HinfⅠ0.9 μL，Buffer2 μL, ddH2O補(bǔ)足20 μL，混勻，瞬時(shí)離心，置37 ℃恒溫水浴箱水浴12 h后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

胃癌患者基因型的分布應(yīng)用Hardy-Weinberg(H-W)平衡軟件計(jì)算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(P>0.05 表明研究人群符合H-W 平衡)，胃癌患者基因型和等位基因頻率的分布采用χ2檢驗(yàn)分析，采用非條件Logistic回歸法計(jì)算比值比(OR)和95%CI。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群的年齡及性別的分布

胃癌組與對(duì)照組的年齡、性別分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.468、P=0.055，P>0.05)，見表1。

表1 兩組被檢人群年齡及性別的分布Tab.1 Distribution of gender and age of two groups

2.2 兩基因位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

FgBβHinfⅠA/C基因多態(tài)性呈A-C兩態(tài)，A等位基因含HinfⅠ酶切位點(diǎn)，當(dāng)A突變?yōu)镃時(shí)，A等位基因缺乏HinfⅠ酶切位點(diǎn)， HinfⅠ位點(diǎn)AA型表現(xiàn)為140 bp和100 bp兩個(gè)片段，AC型表現(xiàn)為240 bp、140 bp和100 bp片段，CC型表現(xiàn)為240 bp片段，見圖1。

注：M為DNA Marker，1、2、4、5、6、8、10為AA基因型，3、7為AC基因型，9位CC基因型圖1 FgBβHinfⅠA/C位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 FgB β Hinf I A/C locus sepharose electrophoretogram

2.3 FgBβHinfⅠA/C基因多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡度檢驗(yàn)

FgBβHinfⅠA/C應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)胃癌組及對(duì)照組的基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，兩組受檢者FgBβHinfⅠA/C基因多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.596、0.011，P=0.440、0.918)，見表2。

表2 FgBβHinfⅠA/C基因位點(diǎn)的H-W平衡檢驗(yàn)Tab.2 FgBβHinfⅠA/C locus H-W balance test

注：P>0.05，符合Hardy-Weinberg平衡

2.4 胃癌組及對(duì)照組FgBβHinfⅠA/C基因型分布和等位基因頻率

結(jié)果顯示，F(xiàn)gBβHinfⅠA/C位點(diǎn)的基因型在胃癌組和對(duì)照組中的比較分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,等位基因在兩組之間的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=6.002，P=O.05;χ2=5.706，P<0.05)，見表3。

表3 FgBβHinfⅠA/C基因位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在兩組中的分布(n,%)Tab.3 Distribution of FgB β HinfIA/C locus genotypefrequency and allele frequency in both groups

2.5 FgBβHinfⅠA/C基因的多態(tài)性與胃癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移的關(guān)系

結(jié)果顯示，F(xiàn)gBβHinfⅠA/C基因的AA、AC及CC基因分型分布與胃癌的臨床分期及轉(zhuǎn)移無關(guān)，各期型頻率分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.905、P>0.05;χ2=0.736、P>0.05)。見表4。

表4 FgBβHinfⅠA/C位點(diǎn)的基因多態(tài)性與不同分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系(n，%)Tab.4 Relationship between FgB β HinfIA/C locus polymorphism and different staging and lymph nodes transfer

2.6 FgBβHinfⅠA/C位點(diǎn)不同基因型對(duì)胃癌的相對(duì)危險(xiǎn)度分析

結(jié)果顯示，F(xiàn)gBβHinfⅠA/C位點(diǎn)的AC型可能與胃癌的發(fā)病有關(guān)聯(lián)，且AC基因型在兩組人群中的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.888，95%CI為1.105～3.224；χ2=5.488，P

表5 FgBβHinfⅠA/C位點(diǎn)各基因型及等位基因?qū)ξ赴┑南鄬?duì)危險(xiǎn)度Tab.5 Relative risk degree of FgBβHinfⅠA/C locus genotypes and allele gene on gastric cancer

3 討論

Fg作為重要的凝血因子，其功能表達(dá)和調(diào)控一直是臨床研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。Humphries等[9]最早發(fā)現(xiàn)了Fg3條鏈的多個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，同時(shí)探討了遺傳機(jī)制在Fg水平調(diào)節(jié)中所起的作用，發(fā)現(xiàn)大約51%的Fg結(jié)構(gòu)功能及水平的異常與基因遺傳缺陷相關(guān)。有研究也表明FgBβ鏈的mRNA 合成是調(diào)控纖維蛋白原整個(gè)分子合成的限速步驟，而其基因?qū)W特征是決定纖維蛋白原功能表達(dá)的主要因素。FgBβ鏈轉(zhuǎn)錄區(qū)8.1 kb的基因長度中，所含有的8個(gè)外顯子僅占1.9 kb,而7個(gè)內(nèi)含子卻為6.2 kb，約占轉(zhuǎn)錄區(qū)基因總長度的76.5%；同時(shí)由于內(nèi)含子區(qū)的基因位點(diǎn)并不直接參與mRNA的轉(zhuǎn)錄，正是機(jī)體存在內(nèi)含子，且大部分基因隨機(jī)變異或突變發(fā)生在這種內(nèi)含子中，而使機(jī)體對(duì)基因突變或變異的耐受能力明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，胃癌組和對(duì)照組的性別、年齡分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)gBβHinfⅠA/C基因多態(tài)性位點(diǎn)在兩組人群等位基因頻率分布均符合H -W平衡定律[11], 說明本項(xiàng)研究人群具有代表性。研究結(jié)果顯示，β-HinfIA/C位點(diǎn)的C等位基因頻率在對(duì)照組為18.5%，這高于孫川等[12-13]報(bào)道的正常人G1689頻率，這可能是由于地區(qū)、種族，環(huán)境的不同所造成。還顯示β-HinfIA/C位點(diǎn)的基因型和等位基因分布在胃癌組和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示β-HinfIA/C位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)。對(duì)胃癌患者進(jìn)行危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示Fgβ-HinfIA/C位點(diǎn)中以AA型及A等位基因作對(duì)照，攜帶AC基因型及C等位基因的個(gè)體患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)分別是攜帶AA基因型及A等位基因的1.888倍和1.737倍(P=0.019和0.017)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，攜帶突變純合子CC型的個(gè)體患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶AA型的1.983倍，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測Fgβ-HinfIA/C位點(diǎn)基因改變可能對(duì)胃癌的發(fā)病起著重要作用，C等位基因可能是胃癌發(fā)病的遺傳危險(xiǎn)因素。進(jìn)行Fgβ-HinfIA/C基因的多態(tài)性與胃癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gβ-HinfIA/C位點(diǎn)的基因多態(tài)性在胃癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，F(xiàn)gβ-HinfIA/C位點(diǎn)的基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)病存在相關(guān)性，F(xiàn)gβ-HinfIA/C位點(diǎn)的C等位基因可能是胃癌的遺傳危險(xiǎn)因素。