劉雨霞， 鄭 菊， 肖子宇， 張文萍， 李 毅， 吳昌學(xué)， 官志忠， 肖 雁*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是指由缺血性、出血性及慢性缺氧缺血性腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合征[1]，被廣泛認為是除阿爾茨海默病后第2種最常見的癡呆類型，其臨床表現(xiàn)主要有神經(jīng)認知障礙、行為癥狀及運動異常[2]，其的主要發(fā)病機制包括炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)在其生理作用被發(fā)現(xiàn)之前，被公認為是一種毒性氣體[3]，而近年的研究表明H2S是一種新型氣體遞質(zhì)，可通過抗炎癥[4]和抗氧化應(yīng)激對心腦血管起到保護作用[5]。有研究指出，H2S對腦缺血小鼠的血腦屏障完整性起著保護作用[6]?，F(xiàn)已證實H2S在氧糖剝奪再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞凋亡中對保持線粒體功能具有一定的作用[7]，但目前尚不清楚H2S對VaD大鼠保護作用的具體機制。本研究利用改良二血管法(2-vessel occlusion,2-VO)制作VaD模型，以NaSH做為H2S供體，探討H2S對VaD大鼠的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 動物、試劑及儀器

1.1.1動物 成年健康雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量220～250 g [購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，合同號SCKY(黔)2018-0001]。

1.1.2試劑 NaSH購于美國Sigma公司，細胞色素C(cytochrome C，Cyt C) 抗體購自美國GeneTex公司，β-actin抗體購自美國Abcam公司，HRP標記的抗鼠二抗購于北京中杉金橋公司，HRP標記的抗兔二抗購于北京中杉金橋公司， BCA蛋白定量試劑、ECL-Plus發(fā)光液購于美國Thermo Fisher Scientific公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購于碧云天生物試劑公司，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性檢測試劑盒檢測試劑盒購于碧云天生物試劑公司，組織提取分離試劑盒購于碧云天生物試劑公司，PVDF膜購于美國Millipore公司。

1.1.3儀器 ELX800UV 酶標儀(美國 Bio-Tec公司)、DMS2-Morris 水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)、Western blot跑膠裝置電源(北京百晶科技公司)、Varioskan LUX多通道酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、GeneGnome XRQ 化學(xué)發(fā)光成像儀(英國SYNGENE公司)。

1.2 方法

1.2.1動物篩選及分組 70只雄性SD大鼠，保持室溫25 ℃、清潔環(huán)境下以純凈水、標準飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)30 d，進行MORRIS水迷宮實驗檢測其學(xué)習(xí)記憶能力。第1～4天對大鼠的定項航行試驗檢測大鼠的學(xué)習(xí)能力項航行試驗檢測大鼠的學(xué)習(xí)能力：將Ⅰ～Ⅳ象限中點作為大鼠入水點，大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠站上平臺(第Ⅲ象限)的間(逃避潛伏期)，若60 s內(nèi)找到平臺即結(jié)束實驗，若未找到則引導(dǎo)其站至平臺上并停留10 s結(jié)束實驗。第5天行空間探索實驗檢測檢測大鼠記憶能力：撤除平臺，仍從各象限中點作為其入水點，記錄其在60 s內(nèi)第1次游經(jīng)平臺原位置所需時間(逃避潛伏期)，以及60 s內(nèi)大鼠穿越平臺目標區(qū)域次數(shù)、目標象限內(nèi)停留時間。選取時間，記憶力相近的SD大鼠60只隨機分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(VaD)、陽性對照組(Nimodipine)、NaSH低劑量組(Low-NaSH)及NaSH高劑量組(High-NaSH)，每組12只。

1.2.2VaD大鼠模型制備 大鼠禁食禁水10 h，按照0.3 mL/100 g體質(zhì)量的劑量經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，仰臥位固定，頸部備皮，碘伏及75%酒精常規(guī)消毒，頸前正中線切口，分離暴露雙側(cè)頸總動脈，假手術(shù)組僅對雙側(cè)頸總動脈進行分離操作但不用手術(shù)線進行結(jié)扎，其他各組均使用手術(shù)線永久結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈；手術(shù)切口使用青霉素粉噴灑預(yù)防傷口感染，縫合皮膚并作常規(guī)消毒。常規(guī)飲食清潔飼養(yǎng)。

1.2.3SD大鼠給藥 造模結(jié)束后，Nimodipine組大鼠給予10 mg/(kg·d)的尼莫地平灌胃給藥(5 g/L尼莫地平按2 mL/kg劑量給藥)、NaSH低劑量組(Low-NaSH)及NaSH高劑量組(High-NaSH)分別30 μmoL/(kg·d) 、100 μmoL/(kg·d) NaSH灌胃給藥(按2 mL/kg劑量給藥)，對模型組和假手術(shù)組大鼠用相同劑量的生理鹽水(2 mL/kg)進行灌胃，共給藥30 d。

1.2.4行為學(xué)實驗 給藥30 d時，各組分別取6只大鼠，按1.2.1項下方法檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2.5樣本制備 水迷宮測試結(jié)束后進行取材。稱重后腹腔注射10%水合氯醛(0.45 mL/100 g)，麻醉后用1×PBS心臟灌注取腦，冰上分離海馬組織，部分用碧云天組織提取試劑盒提取海馬胞漿蛋白，部分于-80 ℃凍存。

1.2.6CytC蛋白的表達 采用Western blot方法檢測， 570 nm波長下測定胞漿BCA蛋白的吸光度值，計算胞漿BCA蛋白濃度，以12 μL/20 μg體系每孔上樣于12%的SDS-PAGE凝膠，30 mA恒流進行電泳分離，200 mA轉(zhuǎn)膜75 min，一抗4 ℃孵育過夜，恢復(fù)室溫孵育1 h，1×TBST洗膜3次(10 min/次)，二抗孵育1 h，1×TBST洗膜3次(10 min/次)，于GeneGnome XRQ中曝光。β-actin作為內(nèi)參。

1.2.7MDA含量測定 凍存組織用1×PBS制成10%勻漿，12 000 r/min、4℃離心10 min，取150 μL上清液加入300 μL TBA檢測液中，沸水浴15 min；同時設(shè)置濃度為1、2、5、10、20、50 μmol/L的標準品制作標準曲線；1 000 g室溫離心10 min，取上清200 μL置于96孔板，Varioskan LUX多通道酶標儀讀取532 nm處吸光度值記為A532；用BCA蛋白定量法測定樣本蛋白濃度記為C樣本，結(jié)合標準曲線計算組織中MDA含量，MDA=[(A532-0.023 1)/0.049 9]÷C樣本。

1.2.8SOD活性測定 凍存組織用SOD樣本制備液制成10%勻漿，12 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清液20 μL置于96孔板，加入WST-8酶工作液160 μL及20 μL反應(yīng)啟動液，按說明書設(shè)置空白對照1、空白對照2、空白對照3，37 ℃孵育30 min；Varioskan LUX多通道酶標儀讀取450 nm、600 nm處吸光度值，OD450nm-OD600nm讀數(shù)即為實測讀數(shù)A樣本；抑制百分率=[(A空白1-A空白2)-(A樣本-A空白3)]/(A空白1-A空白2)，用BCA法測定樣本蛋白濃度C樣本，計算組織中SOD活力單位，SOD活力單位=[抑制百分率/(1-抑制百分率)]/ C樣本。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力

各組大鼠給藥完成后進行Morris水迷宮測試，第1天～4天的定位航行實驗結(jié)果(圖1A)顯示，Sham組大鼠的逃避潛伏期隨實驗天數(shù)增加而縮短，VaD組大鼠逃避潛伏期較Sham組長(P<0.01)、且隨實驗天數(shù)增加逃避潛伏期變化不明顯；Nimodipine組、Low-NaSH組、High-NaSH組大鼠逃避潛伏期較VaD組大鼠短(P<0.01)，且趨勢與Sham組一致，但Low-NaSH組的逃避潛伏期較Nimodipine組及High-NaSH組長(P<0.01)；第5天的空間探索實驗結(jié)果顯示(見圖1 B～D)，與Sham組比較，VaD組大鼠的逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺次數(shù)顯著減少、目標區(qū)域活動時間顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；表明大鼠2-VO術(shù)后30 d學(xué)習(xí)記憶能力及定航能力下降；與VaD組比較，NaSH灌胃處理后大鼠的逃避潛伏期顯著降低、穿越平臺次數(shù)顯著增加、目標區(qū)域活動時間顯著延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Low-NaSH組比較， High-NaSH組大鼠逃避潛伏期顯著縮短、穿越平臺次數(shù)顯著增多、穿越目標區(qū)域活動時間顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：A為第1～5天逃避潛伏期變化，B為逃避潛伏期，C為穿越平臺次數(shù)，D為目標區(qū)域活動時間；(1)與假手術(shù)組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01；(3)與低劑量組比較，P<0.01圖1 各組大鼠Morris水迷宮結(jié)果Fig.1 The effect of NaSh on learning and memory of rats with VaD

2.2 大鼠海馬胞漿CytC表達

以β-actin做內(nèi)參蛋白，用Western bolt方法檢測各組大鼠海馬胞漿蛋白中CytC表達(見圖2)，結(jié)果顯示，與Sham組比較，VaD組CytC表達水平顯著升高(P<0.01)；與VaD組比較，Nimodipine組、High-NaSH組CytC表達水平顯著降低(P<0.05)，Low-NaSH 組降低最顯著(P<0.01)。

(1)與假手術(shù)組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與模型組比較，P<0.01圖2 各組大鼠海馬胞漿CytC蛋白表達(Western bolt)Fig.2 The effect of NaSh on Cyt C expression

2.3 大鼠海馬組織MDA含量

結(jié)果(見圖3)顯示，與Sham組比較，VaD組MDA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與VaD組比較，Nimodipine組、Low-NaSH 組、High-NaSH組MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，High-NaSH組顯著低于Low-NaSH 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；提示NaSH對VaD大鼠的氧化應(yīng)激損傷有保護作用。

(1)與假手術(shù)組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01；(3)與低劑量組比較，P<0.01圖3 各組大鼠腦組織中MDA含量(TBA法)Fig.3 The effect of NaSh on brain tissue MDA levels of rats with VaD

2.4 大鼠海馬組織SOD酶活性

結(jié)果(見圖4)顯示，與比較，VaD組大鼠腦組織SOD酶活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與VaD組比較，Nimodipine組、Low-NaSH 組、High-NaSH組大鼠腦組織SOD酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

(1)與假手術(shù)組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01圖4 各組大鼠腦組織中SOD酶的活性(WST-8)Fig.4 The effect of NaSh on brain tissue SOD activity of rats with VaD

3 討論

VaD患病人數(shù)占所有老年癡呆人數(shù)的15%，是最常見的老年期癡呆之一[8]。近年來，VaD的發(fā)病率隨中國人口老齡化及生活節(jié)奏加快而逐年升高。缺血后慢性低灌注是VaD的常見誘因之一，腦卒中后的慢性低灌注導(dǎo)致腦血流量(cerebral blood flow，CBF)降低，缺氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激和引發(fā)炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激使血管內(nèi)皮細胞，膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞受損從而導(dǎo)致CBF進一步降低進一步減少，這些病理變化發(fā)生在大腦并導(dǎo)致VaD[9]。線粒體是細胞的能量發(fā)生器，在能量代謝、電子傳遞鏈及氧化磷酸化中起著至關(guān)重要的作用。同時還在氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生中起主要作用，ROS是細胞信號傳導(dǎo)和能量穩(wěn)態(tài)的重要介質(zhì)。線粒體膜電位有助于維持線粒體內(nèi)膜和外膜的質(zhì)子梯度，有助于腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的產(chǎn)生。在腦卒中后的慢性低灌注可引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元細胞內(nèi)的線粒體發(fā)生功能障礙[10]。線粒體損傷導(dǎo)致膜電位去極化，從而影響ATP的產(chǎn)生，造成氧化應(yīng)激[11]，導(dǎo)致細胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA受損，激活各類促凋亡因子和凋亡因子[12]，同時破壞ROS產(chǎn)生與細胞抗氧化酶的解毒和清除能力間的穩(wěn)態(tài)，進一步級聯(lián)放大腦組織內(nèi)線粒體損傷并進一步加重缺血引起的組織損傷[13-14]。檢測脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA可以有效反映有機體中的氧化應(yīng)激程度及自由基的含量。由于腦部結(jié)構(gòu)的高脂質(zhì)，它特別容易受到自由基介導(dǎo)的損傷從而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化。缺血再灌注發(fā)生時線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔上的硫醇被氧自由基氧化而誘導(dǎo)開放從而導(dǎo)致線粒體膜電位發(fā)生去極化[15]。此時Cyt C從線粒體內(nèi)釋放至細胞漿中[16]，并引發(fā)后續(xù)的神經(jīng)細胞死亡[17]。SOD作為抗氧化酶之一，其活性具有清除ROS的能力，近期的很多研究表明心臟缺血、肝臟缺血、腦缺血均會導(dǎo)致SOD活性發(fā)生改變，且SOD酶活性與腦缺血所致的癡呆密切相關(guān)。近年來對VaD的發(fā)病機制的研究取得了很大的進展，但目前尚無對VaD的明確治療方案。用抗氧化劑，抗炎劑或增加腦灌注的藥劑治療都未達到令人滿意的結(jié)果。

本研究通過對SD大鼠進行雙側(cè)頸動脈永久性結(jié)扎制作2-VO法VaD動物模型。2-VO法可導(dǎo)致大鼠皮質(zhì)區(qū)域整個CBF突然減少至35%～45%，并導(dǎo)致海馬中CBF減少至60%[18-19]，能最好的模擬人類衰老及卒中后發(fā)生的全腦慢性低灌注所致的VaD。從結(jié)果可以看出VaD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及定航能力明顯降低，且VaD大鼠腦組織中神經(jīng)元細胞胞漿Cyt C表達量顯著升高(P<0.01)、腦組織中MDA含量和SOD酶活性均顯著升高(P<0.01)。這與VaD患者及中動脈閉塞VaD大鼠中血清及紅細胞中SOD含量升高結(jié)果相似[20]。線粒體呼吸鏈酶易受腦缺血損傷，有研究發(fā)現(xiàn)在2-VO的VaD大鼠中，線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性降低，線粒體膜電位發(fā)生去極化，同時ROS含量升高[21]，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元胞漿中Cyt C表達量增加，提示大鼠腦缺血后大腦海馬神經(jīng)元細胞發(fā)生氧化應(yīng)激且線粒體受到損傷。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)VaD大鼠血漿H2S含量降低、學(xué)習(xí)記憶能力受損，NaSH處理后血漿及腦組織中H2S含量升高且學(xué)習(xí)記憶能力增強[22]，但H2S改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機制目前尚不明確。本研究結(jié)果顯示NaSH灌胃處理后VaD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及定航能力都得到改善，且大鼠腦組織中神經(jīng)元細胞胞漿Cyt C表達量降低(P<0.05)、腦組織中MDA含量減少(P<0.01)、SOD酶活性降低(P<0.01)，與陽性對照組趨勢一致。推測NaSH可以通抑制腦缺血損傷造成的氧化應(yīng)激，改善海馬神經(jīng)元中線粒體功能起到神經(jīng)元保護作用，從而改善VaD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。NaSH高低劑量組間比較，100 μmol/kg NaSH灌胃給藥的NaSH高劑量組逃避潛伏期更短、穿越目標區(qū)域次數(shù)更多、目標區(qū)域停留時間更長(P<0.01)，提示高劑量的NaSH對VaD大鼠的神經(jīng)保護能力更強，且高劑量組腦組織中脂質(zhì)氧化水平低于低劑量組(P<0.01)、說明高劑量NaSH處理能較好的降低VaD大鼠腦組織中氧化應(yīng)激水平，但高劑量組海馬胞漿中Cyt C表達量高于低劑量組，推測可能與大鼠神經(jīng)細胞中線粒體的動態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述，NaSH作為外源性H2S的供體，可降低VaD大鼠腦組織的氧化應(yīng)激程度，保護神經(jīng)元細胞中線粒體功能，從而對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用，對于VaD的大鼠模型有很好的治療作用。高劑量NaSH灌胃處理比低劑量NaSH對VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶及定航能力有更好的改善作用，可能與高劑量NaSH能更好的改善VaD中線粒體損傷有關(guān)，但其中具體作用機制仍有待進一步研究。