周 鵬，王 燕，黃高翔，李憶東,2*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,上海 200433；2.上海杉達(dá)學(xué)院國際醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)部，上海 201209)

三氧化二砷(As2O3)是中藥砒霜的主要成分，大量的體內(nèi)和體外實驗證明，As2O3除了能治療血液系統(tǒng)腫瘤(如急性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤等)外，對多種實體惡性腫瘤，如肝癌、食管癌、胃癌、前列腺癌、宮頸癌等也有明顯的抗癌作用[1-3]。目前認(rèn)為，As2O3抗腫瘤作用的機(jī)制較為復(fù)雜，涉及到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和抑制血管生成[5]等多個方面。卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，超過70%的卵巢癌在發(fā)現(xiàn)時已是晚期，伴盆腔或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，死亡率非常高。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，主要觀察了As2O3對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3遷移、侵襲能力的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3(中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號：TCHu185)。

1.2 儀器 預(yù)包被Matrigel膠的Transwell小室(侵襲小室，貨號354480，美國BD Biosciences公司)；Transwell小室，96孔、24孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，35/60 mm 培養(yǎng)皿(美國Corning Costar公司)；u-Dish 35 mm,low Culture-insert劃痕小室(德國Ibidi公司)；A2 型生物安全柜(美國Labconco Corpoation公司)；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀(美國Cole-Parmer Instrument公司)；顯微鏡CKX31(日本Olympus公司)；超低溫冰箱(-80 ℃，日本Sanyo公司)；Western印跡分析蛋白電泳裝置、Western印跡分析轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)；TS-1型定規(guī)搖床、TS-8型脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；LAS-4000型化學(xué)發(fā)光檢測儀(日本Fujifilm公司)；酶標(biāo)測試儀(美國Molecular Devices公司)；數(shù)控三槽恒溫水槽(寧波市海曙天恒儀器廠)

1.3 藥品和試劑 RPMI1640培養(yǎng)液(上海吉諾生物科技有限公司)；胎牛血清(美國BI公司)； As2O3、二苯基四氮唑藍(lán)(MTT)、β-actin抗體、結(jié)晶紫(Sigma公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、NaCl、甘氨酸、含吐溫-20的PBS、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、二甲亞砜(DMSO)、蛋白酶抑制劑(上海博光生物科技有限公司)；化學(xué)底物發(fā)光試劑ECL(美國Thermo Scientific公司)；Rho相關(guān)蛋白激酶(ROCK)1、ROCK2(美國BD Biosciences公司)；MMP-2、MMP-9抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(美國Santa Cruze生物技術(shù)有限公司)；5%積層膠預(yù)混液，10%、12%分離膠預(yù)混液(蘇州新賽美生物科技有限公司)；脫脂奶粉(上海光明乳業(yè)有限公司)；甲醇、無水乙醇等(上?；瘜W(xué)試劑公司)；硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC 膜，美國PALL公司)；蛋白凝膠電泳 Marker(26616，美國Thermo Scientific Pagerular公司)；蛋白酶抑制劑、苯甲基磺酰氟(phenylmethane sulfonyl fuoride，PMSF)(上海康成生物技術(shù)有限公司)；5×蛋白上樣緩沖液(上海生工生物有限公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人卵巢癌細(xì)胞SKOV3用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25%胰酶消化3 min。取2～4 ml上述培養(yǎng)液反復(fù)吹打細(xì)胞成懸液，根據(jù)不同實驗需要，接種于6孔板或者24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞充分貼壁后，進(jìn)行下一步實驗。

1.5 細(xì)胞活力檢測 采用MTT法。將細(xì)胞接種于24孔板中，處理結(jié)束后，棄原培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1～2次，每孔加500 μl含0.5 mg/ml MTT的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。棄含MTT的培養(yǎng)液，室溫下每孔加入DMSO 500 μl，適度吹打充分溶解晶體，后分裝至96孔板，每組設(shè)平行檢測孔4個，每孔100 μl。用酶標(biāo)儀測570 nm處吸光度(D)，取平行檢測孔的平均值作為每組最終數(shù)值。

1.6 As2O3細(xì)胞毒性實驗 細(xì)胞接種于24孔板中，接種數(shù)(1～3)×104個/孔，過夜培養(yǎng)后棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2～3次后加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，1 ml/孔，各實驗組于培養(yǎng)液中加入濃度為1、2、5、10、20 μmol/L的As2O3,對照組加入等量生理鹽水，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2～3次，用MTT法檢測細(xì)胞活力。

1.7 劃痕實驗 采用Ibidi公司u-Dish 35 mm,low Culture-insert劃痕小室制造500 μm標(biāo)準(zhǔn)劃痕，檢測細(xì)胞水平運(yùn)動能力。取60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長密度60%～80%的SKOV3細(xì)胞，胰酶消化，用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，隔夜培養(yǎng)后棄原培養(yǎng)液，As2O3處理組對應(yīng)加入2 μmol/L As2O3預(yù)處理24 h，對照組加入等量溶劑。處理完畢后，消化各組細(xì)胞并接種至上述小室中，每孔70 μl，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞鋪滿小室底部，小心去除硅膠培養(yǎng)壁，PBS輕輕洗滌細(xì)胞2～3次，去除劃痕上方漂浮細(xì)胞，每個培養(yǎng)孔加入完全培養(yǎng)液800 μl，各組加入2 μmol/L As2O3及等量溶劑對照，40倍顯微鏡下觀察劃痕并拍照，記為0 h。繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，40倍顯微鏡下再次觀察劃痕愈合情況并拍照，記為24 h。

1.8 遷移、侵襲實驗 采用Corning Costar公司的Transwell小室，檢測細(xì)胞垂直運(yùn)動能力。取處于對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞正常接種于6孔板中，過夜培養(yǎng)后棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2～3次后更換新鮮培養(yǎng)液，各處理組對應(yīng)加入As2O3，調(diào)節(jié)濃度至1、2、5、10、20 μmol/L，對照組加入等量溶劑，處理24 h。24孔板中加800 μl無血清RPMI1640培養(yǎng)液,Transwell遷移、侵襲小室置于其中浸泡1 h預(yù)平衡備用(侵襲小室置于專用BD 24孔板中)。細(xì)胞處理結(jié)束后消化、吹打成懸液，無血清培養(yǎng)液處理細(xì)胞并配制密度為3×105個(2 ml)的細(xì)胞懸液，作為實際接種細(xì)胞密度3×104個/(200 μl) 的10倍體系備用，以減少誤差，并加入與細(xì)胞預(yù)處理相同濃度的藥物。小室下室加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液800 μl，并加入與細(xì)胞預(yù)處理相同濃度的藥物，上室加對應(yīng)的各組細(xì)胞懸液200 μl，輕輕混勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。處理結(jié)束后棄各孔培養(yǎng)液，PBS浸泡洗滌Transwell小室兩遍，棉簽反復(fù)均勻擦拭去除上室細(xì)胞，冰甲醇固定，PBS浸泡恢復(fù)Transwell膜的性能，0.1%結(jié)晶紫染色，晾干后于200倍視野下隨機(jī)選取6個視野，計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)衡量該組細(xì)胞垂直運(yùn)動能力。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白 取對數(shù)生長期SKOV3，以3×105個/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)后棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2～3次，加入新的上述培養(yǎng)液。根據(jù)實驗需求，各組分別給予2 μmol/L As2O3分別處理0、6、12、24、36、48 h，0 h組給予等量生理鹽水。處理結(jié)束后棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌各組細(xì)胞2次，用1×SDS(含1%蛋白酶抑制劑，1%PMSF)冰上裂解細(xì)胞，提取總蛋白，低溫超聲裂解后加上樣緩沖液并于95 ℃水浴變性，電泳，轉(zhuǎn)膜至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，3%BSA稀釋一抗ROCK1、ROCK2、MMP-2、MMP-9至1∶1000濃度，4 ℃孵育過夜。用含吐溫-20的PBS洗膜3次，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，室溫孵育1.5 h，用含吐溫-20的PBS洗膜3次，ECL顯影。采用圖像分析軟件進(jìn)行條帶吸光度掃描分析表達(dá)豐度。

2 結(jié) 果

2.1 As2O3顯著抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移 作者首先采用Transwell遷移實驗觀察了As2O3對SKOV3細(xì)胞垂直遷移運(yùn)動能力的影響。結(jié)果如圖1A所示，與對照組相比，隨著As2O3濃度逐漸增大，遷移的細(xì)胞數(shù)逐漸降低，2 μmol/L As2O3對SKOV3遷移抑制即達(dá)40%。結(jié)果表明，As2O3可以抑制卵巢癌細(xì)胞的垂直遷移。繼而通過劃痕實驗，進(jìn)一步檢測了As2O3對SKOV3細(xì)胞水平遷移的影響。與對照組相比，2 μmol/L As2O3即可顯著抑制SKOV3細(xì)胞劃痕傷口的愈合(圖1B)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明As2O3也能夠明顯抑制SKOV3細(xì)胞的水平遷移能力。為進(jìn)一步證實As2O3對SKOV3細(xì)胞遷移抑制作用是否與As2O3抑制SKOV3細(xì)胞增殖有關(guān)，作者通過MTT法觀察了As2O3(0～20 μmol/L)對SKOV3細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如圖1C所示，2 μmol/L As2O3對SKOV3細(xì)胞增殖并無影響，濃度高于5 μmol/L的As2O3開始表現(xiàn)出對SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果表明，2 μmol/L的As2O3可明顯抑制SKOV3細(xì)胞的遷移，因此后續(xù)實驗中也以2 μmol/L作為As2O3的處理濃度，進(jìn)一步觀察其對SKOV3細(xì)胞侵襲能力及相關(guān)調(diào)控蛋白的影響。

圖1 三氧化二砷對SKOV3細(xì)胞遷移及增殖的影響Figure 1 Effects of arsenic trioxide on migration and proliferation of SKOV3 cellsA：三氧化二砷對SKOV3細(xì)胞垂直遷移運(yùn)動的影響，圖中黑點(diǎn)為遷移的SKOV3細(xì)胞；B：三氧化二砷對SKOV3細(xì)胞水平遷移運(yùn)動的影響，圖中0 h為劃痕的初始狀態(tài)(Ⅰ和Ⅲ)，24 h為藥物處理后劃痕的愈合狀態(tài)(Ⅱ和Ⅳ)；C：三氧化二砷對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用；As2O3：三氧化二砷；**P<0.01，與對照組比較；a：以對照組為基線對照；b：以0 h為基線對照

2.2 As2O3顯著抑制SKOV3 侵襲能力 用Transwell侵襲小室檢測As2O3對SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果如圖2所示，與對照相比，2 μmol/L As2O3處理可以明顯抑制SKOV3細(xì)胞的侵襲能力，抑制率達(dá)40%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明2 μmol/L As2O3能夠明顯抑制SKOV3細(xì)胞的侵襲能力。

圖2 三氧化二砷對SKOV3細(xì)胞侵襲的影響Figure 2 Effect of arsenic trioxide on invasion of SKOV3 cellsA：圖中黑點(diǎn)代表侵襲的SKOV3細(xì)胞；B：侵襲細(xì)胞數(shù)百分比；與對照組比較

2.3 As2O3對ROCK1、ROCK2表達(dá)的影響 給予SKOV3細(xì)胞2 μmol/L濃度As2O3處理0～48 h，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測ROCK1、ROCK2蛋白的表達(dá)。As2O3處理12 h即出現(xiàn)對SKOV3細(xì)胞中ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)的抑制作用，結(jié)果見圖3，As2O3可顯著抑制ROCK1、ROCK2的表達(dá)，并呈現(xiàn)出時間依賴性。上述結(jié)果表明，As2O3對SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用可能與As2O3下調(diào)ROCK1、ROCK2的表達(dá)有關(guān)。

圖3 三氧化二砷對Rho相關(guān)蛋白激酶(ROCK)1、ROCK2蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effects of arsenic trioxide on the expressions of ROCK1 and ROCK2 proteinsA：蛋白質(zhì)印跡法檢測ROCK1、ROCK2蛋白的表達(dá)；B：ROCK1蛋白的表達(dá)；C：ROCK2蛋白的表達(dá)；n=3，與對照組比較

2.4 As2O3對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表達(dá)的影響 給予SKOV3細(xì)胞2 μmol/L濃度As2O3處理0～48 h，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。As2O3處理48 h時出現(xiàn)對SKOV3細(xì)胞內(nèi) MMP-9表達(dá)的抑制效果，與對照組相比，抑制率約60%(圖4的A、C，P<0.01)；而As2O3對 MMP-2的表達(dá)沒有明顯影響(圖4的A、B)。上述結(jié)果提示，As2O3抑制SKOV3細(xì)胞遷移與侵襲，可能與As2O3下調(diào) MMP-9蛋白的表達(dá)有一定關(guān)聯(lián)。

圖4 2 μmol/L三氧化二砷對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effects of 2 μmol/L arsenic trioxide on the expressions of matrix metallo-proteinase-2 (MMP-2) and MMP-9 proteinsA：蛋白質(zhì)印跡法檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)；B：MMP-2蛋白表達(dá)的柱狀圖；C：MMP-9蛋白表達(dá)的柱狀圖；與對照組比較

3 討 論

As2O3是我國傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，隨著它在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤，特別是在急性淋巴細(xì)胞白血病治療中取得良好效果，其在實體腫瘤中的作用與應(yīng)用也逐步引起人們的重視。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)As2O3對實體瘤的抗癌效果不及對血液系統(tǒng)的腫瘤，且對不同來源的實體腫瘤作用也差異較大，因此深入闡明As2O3對實體廇的作用及機(jī)制具有重要意義。

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，>70%的卵巢癌在發(fā)現(xiàn)時已是晚期，并伴有盆腹腔或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是婦科致死率最高的腫瘤。腫瘤轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤的標(biāo)志之一，一定程度上決定了腫瘤的發(fā)展方向以及患者治療的最終結(jié)局，而細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力和侵襲能力是決定腫瘤轉(zhuǎn)移能力的重要因素。為此，本研究主要探討了As2O3對卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果證實，2 μmol/L As2O3能夠明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞垂直和水平遷移能力，而對細(xì)胞增殖沒有影響；2 μmol/L As2O3還可顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的侵襲能力。

腫瘤的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、多因素參與的生物學(xué)過程，包括原位脫離、黏附基質(zhì)、穿透基底膜、入侵血管淋巴系統(tǒng)、形成轉(zhuǎn)移灶等[6]。ROCK是一種絲蘇氨酸激酶。研究表明，ROCK可通過調(diào)節(jié)其靶蛋白的改變而影響血管平滑肌表型，誘導(dǎo)血管重構(gòu)[7]，同時RhoA/ROCK信號通路還能調(diào)控平滑肌細(xì)胞表型和血管重構(gòu)[8]。ROCK包含ROCK1和ROCK2兩種蛋白異構(gòu)體，兩者激酶結(jié)構(gòu)域上的氨基酸序列一致性為92%，均具有活性和功能。本研究通過實驗證實，As2O3可時間依賴性抑制ROCK1、ROCK2的表達(dá)，可能通過下調(diào)SKOV3細(xì)胞內(nèi)ROCK1、ROCK2蛋白的表達(dá)來抑制SKOV3細(xì)胞的遷移能力。 腫瘤細(xì)胞的侵襲能力除了與細(xì)胞的運(yùn)動能力有關(guān)外，還與其降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，如分泌MMPs和一些蛋白酶的激活物有關(guān)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，As2O3可以選擇性下調(diào) MMP-9蛋白的表達(dá)，而對 MMP-2蛋白無明顯作用。結(jié)果提示，As2O3抑制 MMP-9蛋白的表達(dá)可能參與了其抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲作用。 腫瘤轉(zhuǎn)移過程極其復(fù)雜，包括腫瘤細(xì)胞從原位腫瘤脫落，脫落的腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)黏附、釋放基質(zhì)水解酶破壞和穿過基底膜、侵襲血管和淋巴管、進(jìn)入循環(huán)并最終到達(dá)轉(zhuǎn)移部位，在新的部位定居并增殖。在此過程中，涉及細(xì)胞骨架和形態(tài)的改變、細(xì)胞的黏附和運(yùn)動，期間估計有超過100種以上的蛋白和多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與，包括多種生長因子、細(xì)胞黏附分子、與細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞運(yùn)動有關(guān)的調(diào)節(jié)分子等。作者對As2O3抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3遷移、侵襲能力的機(jī)制探討還只是初步的研究，而此抑制作用是否通過ROCK1、ROCK2、 MMP-9發(fā)揮，是否還存在其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用均需進(jìn)一步的深入研究。