谷孫澤棟，楊曉飛，張佩欣

纖維蛋白原樣蛋白2（fibrinogen-like protein2，FGL2）屬于纖維蛋白原相關蛋白超家族，亦稱FGL2凝血酶原酶，有兩種類型，即膜型FGL2（membrane FGL2，mFGL2）和可溶性 FGL2 （soluble FGL2，sFGL2）。sFGL2主要由調節(jié)性T淋巴細胞（regulatory T cells，Treg）分泌，具有免疫調節(jié)作用，可抑制T細胞增殖和樹突狀細胞成熟。目前，在皮膚移植、腎移植、冠心病等領域，均有研究表明sFGL2具有重要的作用[1]。近年來研究發(fā)現，sFGL2可調節(jié)T細胞反應，對自身免疫性肝炎的發(fā)生和進展具有促進作用。肝癌細胞異常表達FGL2可能促進了腫瘤細胞的生長[2，3]。目前，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者sFGL2的變化及其作用還鮮有研究報道。本研究檢測了CHB患者在抗病毒治療前后血清和肝組織sFGL2水平的變化，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年6月～2017年6月我院收治的CHB患者112例，男68例，女44例；年齡29～48歲，平均年齡為（34.1±7.8）歲。乙型肝炎肝硬化患者112例，男70例，女42例；年齡28～67歲，平均年齡為（44.0±7.7）歲。符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）的診斷標準[4]，且經肝穿刺組織病理學檢查證實。血清HBsAg陽性持續(xù)＞6個月，初始接受抗病毒治療。其中CHB患者輕度38例，中度45例，重度29例。排除其他臟器功能障礙、合并其他慢性肝病、惡性腫瘤、失代償期肝硬化、藥物性肝損傷患者。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 治療方法 給予所有患者恩替卡韋（中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20052237）0.5 mg口服，1次/d。觀察72 w。完全應答：HBV DNA陰轉、ALT復常；部分應答：HBV DNA陰轉或ALT復常；無應答：HBV DNA和ALT均未達到完全應答的標準[5]。

1.3 血清指標檢測 采集受試者空腹靜脈血5 mL，3000 r/m離心10 min，取血清凍存于-80℃?zhèn)錅y。采用ELISA法檢測血清sFGL2水平（美國BioLgend公司）；使用日立7600型全自動生化分析儀及其配套試劑測定血生化指標。

1.4 肝穿刺組織病理學檢查 使用16 G肝活檢穿刺針（美國Bard Magnum型）行肝穿刺活檢，組織長度＞1 cm。經甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片、HE和Masson染色。參考《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）的標準[6]，將肝組織炎癥活動度分為G1～G4級，將肝纖維化分為S0～S4期。采用免疫組織化學法檢測肝組織sFGL2表達，對肝組織石蠟切片行脫蠟、微波修復，過氧化氫孵育10 min，PBS振洗3次；加入1:200稀釋的抗sFGL2抗體（美國BioLgend公司），4℃過夜，吸除抗體，PBS洗滌3次；加二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌；加DAB顯色15～30 s，終止染色，脫水封固。于光學顯微鏡高倍視野下選擇視野，計數陽性細胞數。

1.5 統計學處理 應用SPSS 22.0統計軟件處理數據，計數資料以（n，%）表示，采用x2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組肝組織sFGL2表達情況 肝組織細胞sFGL2陽性表達為細胞內棕褐色或棕黃色顆粒（圖1、圖2）。CHB患者肝組織sFGL2陽性率為63.4%（71/112），肝硬化患者為 82.1%（92/112，P＜0.05）。隨病情程度加重，CHB患者肝組織sFGL2表達陽性率增加。

圖1 CHB患者肝組織sFGL2表達情況（SP，400×）1a：輕度 CHB；1b：中度 CHB；1c：重度 CHB

圖2 肝硬化患者肝組織sFGL2表達（SP，400×）2a：肝硬化患者治療前；2b：肝硬化患者治療72 w末

2.2 兩組血生化指標和sFGL2水平比較 治療后，兩組患者血清ALT和AST水平均顯著降低，肝硬化患者血清sFGL2水平顯著高于CHB患者，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 兩組血生化和sFGL2水平（±s）比較

表1 兩組血生化和sFGL2水平（±s）比較

與肝硬化比，①P＜0.05

例數 ALT（U/L） AST（U/L） sFGL2（μg/L）CHB 治療前 112 77.5±9.2① 86.2±10.7① 118.6±13.4①治療后 112 49.8±6.3① 52.3±7.6① 84.7±10.3①肝硬化 治療前 112 86.9±10.9 101.3±12.5 144.1±17.2治療后 112 41.8±4.2 42.3±5.4 104.9±19.4

2.3 CHB患者血清sFGL2水平變化情況 在治療24 w、48 w和72 w，CHB患者血清sFGL2水平分別 為 （98.2±10.8） μg/L、（81.6±9.5）μg/L 和（69.4±8.7）μg/L，呈依次降低趨勢。在治療72 w末，完全應答65例，部分應答31例，無應答16例，其血清 sFGL2水平分別為（74.6±9.1） μg/L、（97.2±11.4） μg/L 和（123.6±15.2） μg/L，組間差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

FGL2具有兩種表達形式，一是表達于內皮細胞和巨噬細胞的II型跨膜蛋白；二是CD4+CD8+T細胞分泌的可溶性蛋白。mFGL2分子量約為70 kDa左右，被有關研究[7]證實表達于網狀內皮細胞（活化）和巨噬細胞，并具備免疫和凝血效能。sFGL2由Treg細胞分泌，以劑量依賴形式抑制樹突狀細胞成熟和T細胞增殖。在部分病理或生理狀態(tài)下，sFGL2可能出現與mFGL2相反的作用[8，9]。在小鼠模型實驗發(fā)現，sFGL2為Treg細胞活性功能不可或缺的組成成分，并可參與自身免疫性疾病發(fā)展的抑制過程[10，11]。另有研究表明，抗sFGL2特異性抗體可促使Treg細胞功能遭受損害，導致CD8+T細胞數增加，且作用強于轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）阻斷劑，故 sFGL2 可能作為重要的Treg細胞效應分子，通過免疫機制造成肝臟損害[12-14]。

當前，HBV導致的慢性感染患者，其免疫學損傷機制尚未明確。但相關資料顯示，外周血Treg細胞在免疫耐受過程中具有重要的參與作用，且HBV可作為啟動因子對機體免疫功能產生作用，激發(fā)免疫反應，進而造成肝臟損傷[15]。國內外研究發(fā)現，FGL2在自發(fā)性流產、暴發(fā)性病毒性肝炎等以微循環(huán)障礙為特征的病理模型動物表達顯著升高，其介導的纖維素沉積、免疫和凝血功能障礙等與上述病理學損害關系密切[16，17]。FGL2可催化凝血酶原向凝血酶的轉化，開啟凝血級聯通道，造成纖維素局部沉積，造成肝臟微循環(huán)障礙，導致肝細胞壞死。體外實驗表明，Tregs細胞可通過sFGL2促進CD8+T細胞增殖[18]。體內實驗顯示，sFGL2可促使CD8+T細胞干擾素-γ（interferon-γ,IFN-γ）等細胞因子分泌，其通過對CD8+T細胞功能的影響導致肝臟損害，但其機制還需進一步探討[19-20]。本研究結果顯示，CHB患者肝組織sFGL2陽性表達率為63.4%，而肝硬化患者肝組織sFGL2陽性表達率為82.1%，兩組比較差異有統計學意義。CHB患者血清sFGL2、ALT和AST水平在抗病毒治療前后有顯著的變化，且CHB重度患者sFGL2表達高于中度患者或輕度患者，中度患者又高于輕度患者，提示隨CHB病情加重，肝功能損害加重，血清sFGL2水平升高，sFGL2可反映CHB患者的病情。經分析sFGL2參與肝損害機制可能在于，乙型肝炎病毒感染能上調肝內sFGL2表達水平，可激活凝血反應，進而造成局部微循環(huán)障礙，加重肝細胞損傷，進而損害肝功能。

CHB患者多存在不同程度的肝纖維化病理學改變，而肝纖維化是一種進展性慢性肝損傷的反映。若臨床診治不及時，可能發(fā)展至肝硬化甚或肝癌。已有研究發(fā)現，血清sFGL2水平在慢性丙型肝炎患者顯著高于健康人，經抗病毒治療后，血清sFGL2水平降低。外周血sFGL2水平與病情及對治療的應，答和預后關系密切，肝纖維化及炎性反應愈嚴重，sFGL2水平愈高。研究表明，sFGL2不僅能夠抑制T細胞分化和增殖，而且還可干擾樹突狀細胞成熟，并可誘導B細胞、肝細胞、竇狀內皮細胞和腎小管上皮細胞凋亡，其在自身免疫、肝損傷、移植反應等過程中均具有重要的作用?；趕FGL2可經FcγRIIB受體,抑制樹突狀細胞成熟和T細胞活化增殖,誘導B細胞凋亡,研究指出，其有望應用于預防、治療排斥反應及免疫耐受誘導。本研究結果顯示，在治療24周、48周和72周，CHB患者血清sFGL2水平均相比治療前依次降低。肝硬化組sFGL2在治療后表達亦降低。CHB患者肝組織sFGL2表達隨病情程度加重而增加，在對治療不同應答反應的CHB患者，完全應答患者血清sFGL2水平低于部分應答或無應答者，部分應答者又低于無應答者，提示sFGL2對CHB患者對治療應答反應具有指導價值，有助于提示治療反應，并利于臨床療效和預后的評估。這些作用可能與病毒蛋白激活sFGL2轉錄，上調sFGL2表達，干擾肝組織微循環(huán)，通過免疫損害機制，誘導肝細胞凋亡，加重肝細胞損傷有關。