侯永旺，常嬌，王艷輝，任麗

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤［1］。早期肺癌多行手術(shù)聯(lián)合化療的方案，但對(duì)于晚期肺癌患者，化療是其主要的治療方式。化療的藥物種類(lèi)繁多，但以鉑類(lèi)為主的化療方案最為主要。然而，有部分肺癌患者對(duì)于鉑類(lèi)藥物的治療反應(yīng)性很差，即出現(xiàn)順鉑耐藥現(xiàn)象，尤其是非小細(xì)胞肺癌。苯乙雙胍是通常用于治療2型糖尿病的一種雙胍類(lèi)藥物［2］，因其在治療2型糖尿病過(guò)程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)，所以在部分國(guó)家限制了該藥的使用［3］。然而有研究表明，苯乙雙胍具有抗腫瘤活性［4］，并且與2-脫氧葡萄糖（2-DG）聯(lián)合使用可以降低乳酸中毒的發(fā)生率［5］。另外，苯乙雙胍可以干擾肝癌細(xì)胞的線粒體的氧化磷酸化功能，從而達(dá)到抑制腫瘤的作用［6］。但是苯乙雙胍抗腫瘤的作用機(jī)制尚不明確，本研究旨在探討苯乙雙胍對(duì)肺癌細(xì)胞的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP 和A549 細(xì)胞源自于天津醫(yī)科大學(xué)免疫微環(huán)境與疾病省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。主要試劑：DCFH-DA 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑、Mitotracker Red 線粒體示蹤劑和Rhod-2 鈣離子檢測(cè)試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）Annexin V 凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天試劑公司，總DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，抗氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）抗體混合物購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）購(gòu)自美國(guó)BI公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549/DDP 細(xì)胞和A549 細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%小牛血清的1640的培基中，放于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，貼壁24 h后分別加入50μmol/L 順鉑和2.5 mmol/L 苯乙雙胍處理，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，分別檢測(cè)0、24、48 h 的細(xì)胞活力。每孔加入20μL MTS，37 ℃反應(yīng)1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率R1（%）=OD（終時(shí)點(diǎn)）/OD（0h）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 增殖實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為2組，苯乙雙胍組以2.5 mmol/L苯乙雙胍處理，對(duì)照組采用PBS 處理。（1）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞接種于96孔板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，貼壁24 h 后，開(kāi)始對(duì)A549/DDP 細(xì)胞分組處理，之后每孔加入20μL MTS，37 ℃反應(yīng)1 h，在490 nm 處分別檢測(cè)2組不同處理的細(xì)胞第0 h、24 h、48 h的OD值。計(jì)算細(xì)胞增殖率R2（%）=OD（終時(shí)點(diǎn)）/OD（0h）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。（2）克隆形成實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP 細(xì)胞，調(diào)整密度為10 000個(gè)/mL，按照312個(gè)/孔細(xì)胞梯度接種于6孔板，貼壁24 h 后，對(duì)A549/DDP 細(xì)胞分組處理，實(shí)驗(yàn)組每隔2 d 換上含有苯乙雙胍的新鮮培養(yǎng)基；對(duì)照組每隔2 d 換上新鮮培養(yǎng)基，待克隆形成后結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計(jì)2組集落形成的個(gè)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 凋亡實(shí)驗(yàn) 分組及處理同1.2.3，細(xì)胞處理24 h 后，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化，收集于干凈的離心管中，PBS 洗3 遍，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，加入FITC Annexin V 和PI 染料，避光孵育5～10 min后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)凋亡率，凋亡率=Q2區(qū)數(shù)值+Q3區(qū)數(shù)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 胞內(nèi)ROS、線粒體質(zhì)量和線粒體鈣離子檢測(cè) 分組及處理同1.2.3，細(xì)胞處理24 h后，棄去原培養(yǎng)基，加入無(wú)血清的培養(yǎng)基后，分別加入終濃度為10μmol/L DCFH-DA 2 mL 避光反應(yīng)10 min檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS、100 nmol/L Mitotracker Red 2 mL反應(yīng)15 min檢測(cè)線粒體質(zhì)量、4μmol/L Rhod-2 2 mL染色10 min檢測(cè)鈣離子，染色結(jié)束后，消化離心，PBS洗3遍，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，用濾網(wǎng)將細(xì)胞過(guò)濾后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算每組細(xì)胞熒光強(qiáng)度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）。

1.2.6 ATP 檢測(cè) 分組及處理同1.2.3，細(xì)胞處理24 h 后，棄去培養(yǎng)基，置于冰上，PBS洗3遍，加入200μL裂解液裂解細(xì)胞。按照ATP 檢測(cè)試劑盒內(nèi)的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行檢測(cè)，用luminometer 檢測(cè)RLU 值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以與對(duì)照組的倍數(shù)表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 mtDNA檢測(cè) 分組同1.2.3。用總DNA提取試劑盒提取A549/DDP細(xì)胞的總DNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)2組的mtDNA 表 達(dá) 量。 引 物 序 列：Mt -Mito 上 游 5′-CACTTTCCACACAGACATCA-3′， 下 游 5′ - TGGTTA GGCTGGTGTTAGGG - 3′；B2M 上 游 5′- TGTTCCT GCTGGGTAGCTCT-3′，下游5′-CCTCCATGATGCTGCTTACA-3′。PCR反應(yīng)體系：DNA模板200 ng，2μL；引物混合物1μmol/L，8μL；SYBER Green 10μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析：95 ℃10 s，65 ℃60 s，97 ℃1 s，1個(gè)循環(huán)；冷卻：37 ℃30 s，1個(gè)循環(huán)。根據(jù)qPCR得出的熒光曲線的Ct值，以B2M基因?yàn)閮?nèi)參，ΔCt=目的基因Ct值-B2M基因Ct值，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt值-對(duì)照組ΔCt值，用2-ΔΔCt計(jì)算結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)線粒體氧化磷酸化蛋白表達(dá) PBS和2.5 mmol/L 苯乙雙胍處理A549/DDP 細(xì)胞24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗3 遍，每孔加入200μL 含蛋白酶抑制劑的RIPA 細(xì)胞裂解液，在冰上用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，置于冰上30 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清，用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蛋白濃度。每組上樣20μg 蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，60 V 電壓40 min 使蛋白進(jìn)入分離膠，100 V電壓電泳1 h。100 V電壓4 ℃濕轉(zhuǎn)80 min將膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h，4 ℃搖床孵育抗OXPHOS（混合抗體，1∶500稀釋?zhuān)┻^(guò)夜。TBST洗膜3次，室溫孵育二抗（1∶10 000稀釋?zhuān)? h，TBST洗膜3次，使用Immobilon Western 化學(xué)發(fā)光HRP 底物和Tanon 6200 發(fā)光成像儀器檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平，以ATP5A 為內(nèi)參，計(jì)算各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraPh Pad Prism 7.0 和FlowJo 7.6 作圖，SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 順鉑和苯乙雙胍對(duì)A549/DDP 細(xì)胞和A549 細(xì)胞增殖率的影響 （1）組間比較。與順鉑組比較，苯乙雙胍組A549/DDP 細(xì)胞在24 h 和48 h 的細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05），而2組間A549細(xì)胞24 h和48 h增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）組內(nèi)不同細(xì)胞系間比較。48 h 順鉑處理的A549/DDP 細(xì)胞增殖率均高于A549 細(xì)胞（P＜0.05），而24 h 間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；苯乙雙胍處理的A549/DDP 細(xì)胞增殖率24 h 和48 h均低于A549細(xì)胞（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 苯乙雙胍對(duì)A549/DDP 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與PBS組相比較，苯乙雙胍組A549/DDP細(xì)胞的24 h和48 h 增殖率、集落形成數(shù)減低，而凋亡率升高（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖1。

Fig.1 Effects of different treatments on colony number and apoptosis rate of A549/DDP cells圖1 不同處理對(duì)A549/DDP細(xì)胞克隆形成個(gè)數(shù)和凋亡率的影響

2.3 苯乙雙胍對(duì)A549/DDP 細(xì)胞線粒體功能的影響 與PBS組相比，苯乙雙胍組的A549/DDP細(xì)胞內(nèi)ROS 水平增高，Mitotracker、Rhod-2、mtDNA 及ATP水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。Western blot 結(jié)果顯示，用苯乙雙胍組的A549/DDP細(xì)胞線粒體氧化磷酸化復(fù)合物Ⅰ中的NDUFB8、復(fù)合物Ⅱ中的SDHB和復(fù)合物Ⅳ中的MTCO1 蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表4。

3 討論

順鉑是臨床上治療肺癌的主要化療藥物，但是隨著順鉑耐藥的出現(xiàn)，使得順鉑的使用和療效在一定程度上受到了限制。苯乙雙胍是治療糖尿病的雙胍類(lèi)藥物，能夠促進(jìn)多種癌細(xì)胞死亡，但是苯乙雙胍在A549/DDP細(xì)胞中的作用機(jī)制尚鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，與順鉑組比較，苯乙雙胍組A549/DDP 細(xì)胞在24 h的細(xì)胞活力比降低，而2組間A549細(xì)胞24 h活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了排除因?yàn)樗幬镒饔脮r(shí)間所導(dǎo)致的不穩(wěn)定性，本研究檢測(cè)了2 組藥物作用48 h 對(duì)兩種細(xì)胞活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與順鉑組比較，苯乙雙胍組A549/DDP細(xì)胞在48 h的細(xì)胞活力比降低，而2組間A549細(xì)胞48 h活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用順鉑處理的兩種細(xì)胞在24 h 細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也許是因?yàn)樗幬镒饔脮r(shí)間短所導(dǎo)致。但是在48 h，順鉑處理的A549/DDP細(xì)胞活力比A549 細(xì)胞活力高；而苯乙雙胍處理的A549/DDP 細(xì)胞活力低于A549細(xì)胞，表明A549/DDP細(xì)胞較A549細(xì)胞對(duì)苯乙雙胍更為敏感。

Tab.1 Effects of two drugs on the proliferation rate of different cells表1 2種藥物對(duì)不同細(xì)胞增殖率的影響 （n=3，%，±s）

Tab.1 Effects of two drugs on the proliferation rate of different cells表1 2種藥物對(duì)不同細(xì)胞增殖率的影響 （n=3，%，±s）

＊P＜0.05；t1、t2表示2組內(nèi)不同細(xì)胞系間24 h、48 h比較

組別順鉑組苯乙雙胍組t A549/DDP細(xì)胞24 h48 h24 h48 h 83.113±7.59765.683±10.24065.516±12.39644.386±30.363±5.03317.877±5.29248.550±5.03333.790±10.026＊7.184＊2.1961.90 A549細(xì)胞8.139 5.132 7 t1 t2 2.096 4.425＊2.820＊3.739＊

Tab.2 Effects of phenformin on proliferation rate,colony number and apoptosis rate of A549/DDP cells表2 苯乙雙胍對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖率、集落形成數(shù)、凋亡率的影響 （n=3，±s）

Tab.2 Effects of phenformin on proliferation rate,colony number and apoptosis rate of A549/DDP cells表2 苯乙雙胍對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖率、集落形成數(shù)、凋亡率的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05

組別PBS組苯乙雙胍組t增殖率（%）24 h 267.840±42.246 33.949±8.430 9.404＊48 h 512.438±44.416 19.210±7.024 18.998＊集落形成數(shù)（個(gè)/視野）158.000±37.041 3.333±1.528 7.226＊凋亡率（%）6.987±2.405 33.950±4.727 8.805＊

Fig.2 Effects of phenformin on ROS,Mitotracker and Rhod-2 in A549/DDP cells圖2 苯乙雙胍對(duì)A549/DDP細(xì)胞內(nèi)ROS，Mitotracker和Rhod-2的影響

Tab.3 Effects of phenformin on mitochondrial function of A549/DDP cells表3 苯乙雙胍對(duì)A549/DDP細(xì)胞線粒體功能的影響 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of phenformin on mitochondrial function of A549/DDP cells表3 苯乙雙胍對(duì)A549/DDP細(xì)胞線粒體功能的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05；表中ROS，Mitotracker，Rhod-2的數(shù)據(jù)是熒光強(qiáng)度值（FI），mtDNA和ATP的值是標(biāo)準(zhǔn)化以后的倍數(shù)值

組別ROS Mitotracker Rhod-2mtDNA ATP PBS組苯乙雙胍組t 2 042 333±354 367 3 103 333±544 548 2.829＊471 000±110 436 251 333±42 063 3.220＊20 133±5 390 5 744±868 4.565＊1.000 0±0.000 0 0.720 4±0.116 3 4.165＊1.000 0±0.000 0 0.558 3±0.077 0 9.934＊

Fig.3 Western blot detection of OXPHOS protein expression in two groups圖3 Western blot檢測(cè)2組OXPHOS蛋白的表達(dá)

Tab.4 Relative expression of OXPHOS protein表4 OXPHOS蛋白相對(duì)表達(dá)量（n=3，±s）

Tab.4 Relative expression of OXPHOS protein表4 OXPHOS蛋白相對(duì)表達(dá)量（n=3，±s）

＊P＜0.05

組別PBS組苯乙雙胍組t MTCO1 1.000 0±0.000 0 0.476 7±0.155 4 5.835＊SDHB 1.000 0±0.000 0 0.263 3±0.070 2 18.166＊NDUFB8 1.000 0±0.000 0 0.356 7±0.102 6 10.857＊

Yanjun等［7］研究發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍能夠抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和克隆形成，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡，Wang等［8］研究發(fā)現(xiàn)，苯乙雙胍可以抑制肺癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PBS 組相比較，苯乙雙胍組A549/DDP細(xì)胞的24 h和48 h增殖率、集落形成數(shù)減低，而凋亡率升高，表明苯乙雙胍能夠明顯抑制A549/DDP 細(xì)胞增殖、克隆形成并促進(jìn)其凋亡，提示苯乙雙胍可能是治療耐順鉑肺癌的潛在藥物。研究表明，苯乙雙胍在LKB-1缺失肺癌中具有抗腫瘤活性［9］，在細(xì)胞代謝應(yīng)激狀態(tài)下，LKB-1 是激活A(yù)MPK的主要激酶，而AMPK 是一種高度保守的能量傳感器和細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝調(diào)節(jié)劑，苯乙雙胍通過(guò)LKB-1/AMPK 通路發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用，可抑制AMPK 磷酸化，降低其對(duì)于苯乙雙胍的作用［10］。Matsuzaki 等［11］發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍可抑制線粒體氧化磷酸化復(fù)合體Ⅰ的活性，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果。線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，其在細(xì)胞能量代謝、生物合成和細(xì)胞死亡的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，參與了腫瘤細(xì)胞活性氧自由基穩(wěn)態(tài)變化、組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力以及抵抗細(xì)胞死亡［12］。線粒體對(duì)于清除ROS有重要作用，線粒體功能破壞后膜電位受損，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 聚集，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。本研究結(jié)果表明，與PBS 組相比，苯乙雙胍組的A549/DDP 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平增高，Mitotracker、鈣離子水平減低，表明在A549/DDP細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位減低，這可導(dǎo)致ROS堆積。這些結(jié)果與Liu等［14］發(fā)現(xiàn)的線粒體膜電位受損可導(dǎo)致ROS 增多，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡結(jié)果相似。因此，筆者推測(cè)苯乙雙胍促進(jìn)A549/DDP細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)破壞線粒體膜電位、增加胞內(nèi)ROS這一機(jī)制發(fā)揮作用。

癌細(xì)胞存活需要大量ATP來(lái)滿足其自身增殖過(guò)程中生物合成所需的能量，而線粒體的主要功能之一就是通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP。Goscinski等［15］研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA減少、MTCO1表達(dá)蛋白降低、ATP水平降低會(huì)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果顯示，與PBS 組相比，苯乙雙胍組的A549/DDP 細(xì)胞內(nèi)mtDNA 及ATP 水平降低，線粒體氧化磷酸化復(fù)合物Ⅰ中的NDUFB8、復(fù)合物Ⅱ中的SDHB和復(fù)合物Ⅳ中的MTCO1 蛋白表達(dá)量明顯降低，與Goscinski 等［15］和Kang 等［16］結(jié)果相似。目前研究普遍認(rèn)為苯乙雙胍可以抑制線粒體氧化磷酸化復(fù)合物Ⅰ，而本結(jié)果顯示苯乙雙胍還同時(shí)抑制了A549/DDP 細(xì)胞線粒體氧化磷酸化復(fù)合物Ⅱ和復(fù)合物Ⅳ，這也許是細(xì)胞系不同導(dǎo)致的差異，還需要進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。因此，苯乙雙胍能夠減少mtDNA，抑制氧化磷酸化，從而導(dǎo)致ATP 生成減低，這也許是苯乙雙胍抑制A549/DDP細(xì)胞增殖的另一種可能的機(jī)制。