馬珂，徐會友，趙飛，張健，江繼鵬，代晨，王仁杰，陳旭義△

新生兒缺血缺氧性腦?。℉IE）是圍生期常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴重影響嬰兒的神經(jīng)發(fā)育，也是全球新生兒死亡的重要原因之一［1］。流行病學顯示，HIE在發(fā)達國家的發(fā)病率約為活產(chǎn)兒的1‰～3‰，在發(fā)展中國家則高達活產(chǎn)兒的26‰，約有20%～25%的患兒在新生兒期死亡，25%的患兒伴有永久性的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［2］，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。HIE 病理改變主要是大腦血流動力學紊亂，進而引起原發(fā)性損傷和缺血再灌注損傷［3］。世界范圍內(nèi)對HIE 的醫(yī)學研究聚焦于開發(fā)新的有效的治療途徑，但當前仍以支持性對癥治療為主［4］。

胰島素樣生長因子-1（Insulin-like growth factor-1，IGF-1）是一種促生長肽類激素，是由70 多個氨基酸構(gòu)成的單鏈多肽。IGF-1 受體分布廣泛，IGF-1 與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮促進細胞活性，增殖分化等作用［5］。已有研究表明，IGF-1在神經(jīng)再生與修復領(lǐng)域的研究初顯成效，可誘導神經(jīng)細胞增殖分化，在神經(jīng)營養(yǎng)、代謝調(diào)控、胚胎發(fā)育等方面具有廣闊的臨床應用前景［6-7］。本研究利用氯化鈷（Cobalt chloride，CoCl2）干預鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12 細胞系，制備神經(jīng)細胞缺氧損傷模型，初步研究IGF-1對低氧所致PC12細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 PC12細胞系購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、胎牛血清均購自Gibco，兔抗大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、GAPDH、HIF-1α 多克隆抗體，HRP 標記山羊抗兔IgG 二抗均購自Proteintech，HIF-1α 抑制劑2-MeOE 購自Selleck，CoCl2購自Aladin，CCK-8 檢測試劑盒、TUNEL 細胞凋亡試劑盒購自Roche。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞的培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素）中，于37 ℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)傳代，2～3 d傳代1次。

1.2.2 IGF-1和CoCl2干預濃度篩選 取對數(shù)生長期的PC12細胞，以5×104/mL 的密度鋪于96 孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h 后，分別加入10、20、40、80μmol/L 的CoCl2溶液10μL，37 ℃、5%CO2條件下孵育8、16、24、32 h，向每個加樣孔中加入10μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度（A），計算細胞活力。細胞活力（%）=［A（加藥）-A（空白）］/［A（0 加藥）-A（空白）］×100%，得出干預最佳濃度。分別加入100、200、400μg/L 的IGF-1溶液10μL，再次放入37 ℃5%CO2條件下孵育24 h，參照上述方法檢測細胞活力，得出干預最佳濃度。

1.2.3 實驗分組 實驗分為對照組（未經(jīng)任何處理的PC12細胞）、CoCl2組（加入CoCl2干預）、CoCl2+IGF-1 組（用IGF-1預處理24 h后，再加入CoCl2）。

1.2.3.1 CCK-8 法檢測細胞活力 按上述分組進行干預，37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h 后按照1.2.2 中的步驟計算各組細胞活力。

1.2.3.2 TUNEL 法檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的PC12細胞接種于酪氨酸包被的玻片上，按上述分組對細胞進行干預24 h，4%的多聚甲醛溶液浸泡30 min。PBS 沖洗3 次，0.1%Triton X-100 透化2 min，PBS 洗滌2 次，加入TUNEL 混合液于37 ℃避光孵育60 min，Streptavidin-HRP 標記30 min，DAB 顯色后封片固定，光學顯微鏡下隨機取3 個視野進行觀察并計數(shù)，計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)（%）=TUNEL 陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.3.3 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達 取各組干預后24 h的細胞，預冷PBS清洗3次，細胞刮刀刮脫細胞，收集至離心管，1 000 r/min 離心5 min，冰上按照1×107個細胞/mL加入配制好的細胞裂解液，反復吹打至蛋白析出，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清即為蛋白提取物。BCA法進行蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)NC 膜。雜交步驟如下：5%脫脂牛奶封閉NC 膜1 h，PBST 洗滌10 min×3 次，然后室溫下與兔抗鼠一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）、Caspase-3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）雜交反應1 h，PBST洗滌10 min×3次。再將NC膜與山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）雜交反應1 h，PBST洗滌10 min×3 次。NC 膜滴加等量A、B混合顯影液，凝膠成像系統(tǒng)進行顯影，使用Image J 軟件進行目的蛋白和內(nèi)參的灰度值測定，得出目的蛋白相對灰度值。

1.2.4 IGF-1對HIF-1α表達的影響 此部分實驗設CoCl2處理組、IGF-1+CoCl2處理組、2-MeOE2組（2-MeOE2 10μmol/L預孵化24 h后，再加入CoCl2）、2-MeOE2+IGF-1組（用IGF-1和2-MeOE2 10μmol/L預孵化24 h后，再加入CoCl2）。上述4組細胞處理結(jié)束后提取蛋白，參照1.2.3.3中的步驟，Western blot法檢測HIF-1α和Bax的表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 及GraphPad 5.0 軟件分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間計量資料比較采用單因素方差分析或2×2析因設計方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2 結(jié)果

2.1 CoCl2及IGF-1對PC12細胞活力的影響 選用不同濃度的CoCl2對PC12 細胞進行不同時長的干預，CCK-8 結(jié)果顯示，同一作用時間，隨著干預濃度的增加，PC12的細胞活力逐漸下降；同一濃度下，隨著時間的延長，細胞活力仍是下降的。當40μmol/L作用24 h 時，細胞活力約下降至50%（圖1A），因此選用此濃度和作用時長制備細胞低氧模型進行后續(xù)研究。同樣，選取不同濃度的IGF-1對PC12細胞進行24 h 的預孵化，CCK-8 結(jié)果顯示，與對照組相比，200μg/L 的IGF-1 可明顯提高細胞活力，而當濃度達到400μg/L 時，細胞活力與200μg/L 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1B。因此，后續(xù)實驗選用200 μg/L 的IGF-1 作為干預濃度，對細胞進行預孵化。

2.2 IGF-1對PC12缺氧模型細胞存活的影響 3組細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義（F=89.70，P＜0.01），與對照組相比，CoCl2組細胞存活率下降；而經(jīng)IGF-1預處理后，CoCl2+IGF-1 組細胞存活率較CoCl2組明顯升高（P＜0.01），見圖2A。光鏡下可見對照組細胞生長良好，CoCl2組細胞數(shù)量明顯減少，胞體變小，軸突縮短；而經(jīng)IGF-1 預處理后，CoCl2+IGF-1 組細胞數(shù)量較CoCl2組顯著增加，且軸突延長，見圖2B。

2.3 IGF-1 對PC12 細胞CoCl2誘導的凋亡的影響 TUNEL 染色結(jié)果示，CoCl2+IGF-1 組較CoCl2組TUNEL（+）細胞數(shù)顯著減少，TUNEL（+）細胞比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義，見圖3。

2.4 IGF-1對CoCl2誘導的PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，CoCl2組抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下調(diào)（P＜0.05），促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達上調(diào)（P＜0.05）；經(jīng)過IGF-1預處理后，CoCl2+IGF-1組較CoCl2組Bcl-2表達上調(diào)，Bax、Caspase-3 表達下調(diào)（P＜0.05）。見圖4、表1。

2.5 IGF-1 對HIF-1α 表達的抑制作用 Western blot 結(jié)果顯示，與CoCl2組相比，CoCl2+IGF-1 組和CoCl2+2-MeOE2 組HIF-1α 和Bax 蛋 白 表 達 降 低（P＜0.05），兩者聯(lián)合應用時HIF-1α 蛋白表達降低（P＜0.01）；兩者具有交互作用；而CoCl2+2-MeOE2+IGF-1組與CoCl2+2-MeOE2組HIF-1α和Bax蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義。見圖5、表2。

3 討論

Fig.2 The effect of IGF-1 on cell survival in PC12 hypoxic model圖2 IGF-1對PC12缺氧模型細胞存活的影響

Fig.3 The inhibitory effect of IGF-1 on the apoptosis of PC12 cells induced by CoCl2 observed by TUNEL staining圖3 TUNEL染色觀察IGF-1對CoCl2誘導的PC12細胞凋亡的抑制作用

Fig.4 The effect of IGF-1 on the expression of CoCl2-induced apoptosis-related proteins in PC12 cells detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測IGF-1對CoCl2誘導的PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Tab.1 Comparison of relative expression levels of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins between three groups表1 各組相關(guān)蛋白相對表達量的比較 （n=3，±s）

Tab.1 Comparison of relative expression levels of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins between three groups表1 各組相關(guān)蛋白相對表達量的比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與CoCl2組比較，P＜0.05

組別對照組CoCl2組CoCl2+IGF-1組F Bcl-2/GAPDH 0.844±0.027 0.283±0.004a 0.723±0.031ab 153.80＊＊Bax/GAPDH 0.284±0.046 0.950±0.227a 0.546±0.046ab 70.67＊＊Caspase-3/GAPDH 0.464±0.034 0.913±0.142a 0.768±0.022ab 83.88＊＊

HIE 是圍生期常見的小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高致死率和高致殘率的特點，在HIE的治療方面，目前臨床并無療效顯著的治療方法，主流的治療方法包括神經(jīng)營養(yǎng)性藥物［8］、亞低溫療法［9］、干細胞移植［10］等多種途徑的聯(lián)合治療，單一的治療方法對該病治療效果非常有限，很難徹底治愈。因此，探索HIE 確切的致病機制，以此為依據(jù)研究一種安全有效的治療方法顯得尤為迫切。

Fig.5 Western blot assay showing HIF-1α and Bax expressions in four groups圖5 Western blot 檢測各組HIF-1α、Bax表達

Tab.2 Variance analysis of factorial design of relative expression levels of HIF-1α and Bax proteins between four groups表2 各組HIF-1α及Bax蛋白相對表達量的析因設計方差分析 （n=3，±s）

Tab.2 Variance analysis of factorial design of relative expression levels of HIF-1α and Bax proteins between four groups表2 各組HIF-1α及Bax蛋白相對表達量的析因設計方差分析 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與CoCl2組比較，b與CoCl2+IGF-1 組比較，P＜0.05

組別CoCl2組CoCl2+IGF-1組CoCl2+2-MeOE2組CoCl2+2-MeOE2+IGF-1組FIGF-1 F2-MeOE2 F交互HIF-1α/GAPDH 0.973±0.037 0.814±0.011a 0.206±0.014ab 0.250±0.025ab 6.942＊932.048＊＊21.890＊＊Bax/GAPDH 1.007±0.059 0.804±0.008a 0.318±0.013ab 0.343±0.021ab 7.535＊316.498＊＊12.383＊＊

筆者利用CoCl2干預PC12細胞系制造缺氧神經(jīng)損傷模型。CoCl2作為一種常用的缺氧誘導劑，已在多個領(lǐng)域成熟應用［11-12］，例如肝癌細胞缺氧模型［13］，神經(jīng)干細胞缺氧模型［14］等。通過對CoCl2不同作用濃度不同作用時長對細胞活力的影響分析，40μmol/L 作用24 h會使細胞活力降至50%左右，以上結(jié)果表明，40μmol/L CoCl2作用24 h 能夠較準確地模擬新生兒缺血缺氧性腦病時神經(jīng)損傷的程度，建立新生兒缺血缺氧性腦病細胞模型。IGF-1受體及受體后信號傳遞因子分布于整個大腦，IGF-1 通過作用于這些特異性受體來調(diào)節(jié)腦內(nèi)代謝以及神經(jīng)活性、線粒體功能等［15］。已有研究表明，IGF-1可促進神經(jīng)元的生成以及突觸的連接，但其具體作用機制仍需探索［16-17］。本研究利用IGF-1 干預CoCl2誘導的缺氧細胞模型，結(jié)果表明IGF-1能夠抑制CoCl2的毒性作用，增強PC12 細胞活力，并且上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax，抑制低氧所致的細胞凋亡作用，并且應用2-MeOE2競爭性抑制HIF-1α，證實IGF-1是通過下調(diào)上游蛋白HIF-1 的轉(zhuǎn)錄活性來發(fā)揮其凋亡抑制作用的。

已有研究表明CoCl2可以通過穩(wěn)定HIF-1α誘導缺氧［18］。然而，CoCl2誘導缺氧條件下活性氧生成機制尚不清楚，但近些年有研究證實CoCl2可以增加細胞HIF-1α的表達［19-20］，從而誘導細胞缺氧損傷。本次實驗發(fā)現(xiàn)，CoCl2可以增加PC12 細胞HIF-1α 和Bax的表達，而當HIF-1α受到抑制時，Bax的表達也顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，CoCl2是通過HIF-1信號通路誘導缺氧條件下細胞凋亡的。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CoCl2+2-MeOE2+IGF-1 組與CoCl2+2-MeOE2 組HIF-1α 和Bax 蛋白的表達無明顯差異，提示2-MeOE2通過競爭性抑制HIF-1α的表達，而使IGF-1的干預對HIF-1α 的表達無影響。進一步證實了IGF-1通過抑制HIF-1α的表達，抑制缺氧條件的細胞凋亡，從而發(fā)揮其對PC12細胞的神經(jīng)保護作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示IGF-1 可抑制CoCl2誘導的PC12 細胞凋亡，其神經(jīng)保護作用與HIF-1α/Bax 信號通路相關(guān)聯(lián)。HIE 發(fā)生發(fā)展過程中，IGF-1與HIF-1α等蛋白的表達與神經(jīng)元變性密切相關(guān)，其中具體的作用位點及關(guān)聯(lián)模式將成為下一步探索的目標，這些都為HIE的臨床治療提供了新的思路，為新的藥物研發(fā)提供了理論依據(jù)。