張輝，林松，熊希倩，閆學(xué)強，余晨，高偉，胡曉麗，趙麗，詹江華△

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是以肝內(nèi)外膽管進行性炎癥、纖維性梗阻、肝內(nèi)膽汁淤積及進行性肝纖維化為主要特征的嬰幼兒肝膽疾?。?］。目前，BA患兒長期自體肝生存率仍不理想，有報道20年自體肝生存率不足20%，30年自體肝生存率僅10%［2-3］。膽管板畸形（ductal plate malformation，DPM）是由于胚胎期門管區(qū)膽管板重塑發(fā)生障礙，表現(xiàn)為門管區(qū)結(jié)締組織周圍存在環(huán)狀膽管結(jié)構(gòu)，類似于原始的膽管結(jié)構(gòu)［4］。影響B(tài)A自體肝生存的因素很多，如患兒年齡、BA分型、肝纖維化程度等。目前有關(guān)DPM對BA 患兒自體肝生存的因素尚少見報道，基于此，本研究收集BA 患兒行Kasai 術(shù)及肝移植（liver transplantation，LT）時的肝組織標(biāo)本，結(jié)合患者臨床資料，探討DPM與自體肝生存時間關(guān)系，為判斷BA患兒的臨床預(yù)后提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源與分組 收集2008年1月—2017年12月在天津市兒童醫(yī)院經(jīng)術(shù)中膽道造影及肝活檢確診為Ⅲ型BA且行Kasai手術(shù)，最終因肝功能衰竭在天津市第一中心醫(yī)院行LT，并得到完整隨訪的患兒40 例，其中男12 例，女28 例。Kasai手術(shù)日齡60.50（51.75，73.00）d，LT 手術(shù)日齡276.50（213.50，504.00）d。本研究經(jīng)天津市兒童醫(yī)院和天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會討論通過。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗人CK-19單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG 二抗與DAB（3，3-二氨基聯(lián)苯胺）顯色試劑盒均購自北京博奧生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肝組織標(biāo)本處理 取BA 患兒Kasai 術(shù)及肝移植時肝組織標(biāo)本（Kasai 術(shù)時取肝右葉前緣約0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm楔形組織1 塊，肝移植時取不同部位約1 cm×1 cm×0.5 cm 肝組織3～5塊），經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，8～24 h后經(jīng)石蠟包埋、切片（4μm），所有過程均處于同一實驗條件。

1.3.2 HE染色 病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗，蘇木素浸染5 min，經(jīng)酸化伊紅乙醇溶液浸染2 min，梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹膠封片等一系列操作。鏡下觀察DPM 形成情況。根據(jù)Pacheco 等［5］的描述，明確的DPM指門管區(qū)結(jié)締組織周圍存在完整的或幾乎完整的環(huán)狀膽管結(jié)構(gòu)，類似于原始的膽管結(jié)構(gòu)；可能的DPM指在小間充質(zhì)細胞核周圍形成不明顯偏心性和（或）與門脈不相關(guān)的較小致密小環(huán)。本研究將上述2種情況都定義為存在DPM。

1.3.3 免疫組化染色 病理切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫，PBS 沖洗5 min×3 次，于3%H2O2中37 ℃孵育10 min，再用PBS 沖洗5 min×3次，滴加CK-19 一抗，于冰箱中4 ℃過夜，次日取出置于室溫30 min，PBS洗5 min×3次，加二抗后37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次，經(jīng)DAB 顯色5～10 min，充分水洗，蘇木素染核，脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下觀察染色情況。

1.3.4 臨床特征分析 整理BA 患兒Kasai 術(shù)及肝移植時的臨床資料，統(tǒng)計是否伴發(fā)肝外畸形，包括多脾、十二指腸前門靜脈、心血管缺損、內(nèi)臟轉(zhuǎn)位、腸旋轉(zhuǎn)不良和肝臟循環(huán)異常。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 22.0軟件包進行統(tǒng)計處理，非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)及四分位數(shù)M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPM 及肝外畸形的發(fā)生情況 40 例患者中行Kasai 術(shù)時13 例（32.5%）存在DPM，行LT 時23 例（57.5%）存在DPM，所有LT 時存在DPM 的患兒在Kasai 術(shù)時已存在。其中1 例患兒伴發(fā)肝外先天性畸形（鏡像右位心和房間隔缺損）。

2.2 有無DPM組間自體肝生存時間比較 行Kasai術(shù)時和接受LT 時，有DPM 組患兒的自體肝生存時間均較無DPM 組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of autologous liver survival time between the two groups表1 2組間自體肝生存時間的比較 M（P25，P75）

2.3 有無DPM組間自體肝生存曲線 Kasai術(shù)時和接受LT 時，相較于無DPM 的BA 患兒，有DPM 患兒的自體肝存活率明顯下降，見圖1、2。

Fig.1 Comparison of autologous liver survival curves between children with ductal plate malformation and children without ductal plate malformation during Kasai operation圖1 Kasai術(shù)時有無膽管板畸形自體肝生存曲線比較

Fig.2 The autologous liver survival curves in children with ductal plate malformation and children without ductal plate malformation during liver transplantation operation圖2 肝移植時有無膽管板畸形患兒自體肝生存曲線

2.4 病理結(jié)果 無論是否存在DPM，2組Kasai術(shù)時鏡下都有共同的病理特點：匯管區(qū)增寬，膽管增生，肝細胞濁腫淤膽，部分可見膽栓和膽汁湖，纖維組織增生，橋接纖維化程度普遍，部分可見假小葉形成趨勢，伴炎癥細胞浸潤。2 組LT 時也有共同的病理特點：肝臟纖維化較Kasai 術(shù)時加重，有假小葉形成?？梢娒鞔_的DPM（圖3A）和可能的DPM（圖3B）。上述2種結(jié)構(gòu)中CK-19均呈陽性表達，見圖4。

Fig.3 Morphological patterns of ductal plate malformation（×100）圖3 膽管板畸形HE染色結(jié)果（×100）

Fig.4 The immunohistochemical staining of CK-19 in ductal plate malformation（×100）圖4 膽管板畸形CK-19免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×100）

3 討論

胚胎發(fā)育第7周形成原始肝臟，第8周形成膽管板［6］。膽管板是肝內(nèi)膽管發(fā)育的基礎(chǔ)，胚胎發(fā)育過程中，其單層膽管上皮細胞分化為雙層，一層與門靜脈周圍間質(zhì)相接觸，另一層與肝實質(zhì)相接觸，這兩層細胞之間存在裂隙樣管腔。此后，膽管板隨門靜脈的分支逐漸由肝門向肝臟外周方向發(fā)展［7］。膽管板重塑過程也是按照這一方向進行，出生時肝門附近的膽管板重塑完成并形成膽管，但肝臟周邊的膽管仍處于膽管板狀態(tài)［8］。膽管板重塑的機制仍不清楚，有學(xué)者推測可能與上皮細胞生長調(diào)節(jié)因子、間質(zhì)及門靜脈的作用有關(guān)，如果這些過程的任一環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，則可導(dǎo)致膽管板重塑不完全甚至不重塑，最終使過多的胚胎狀態(tài)的膽管板持續(xù)存在，這種異常就稱為DPM［9］。

按照Davenport［10］最新的BA 分型方法，其中伴發(fā)肝外先天畸形的類型稱為膽道閉鎖脾臟畸形綜合征型（biliary atresia splenic malformation，BASM），包括脾臟畸形（多脾）、心血管畸形（十二指腸門靜脈癥和心血管缺陷）、內(nèi)臟轉(zhuǎn)位等。這種發(fā)育異常可能發(fā)生在妊娠期20～40 d，這部分患兒Kasai 術(shù)后效果較差，會早期完成LT［11］。有研究認為BA 患兒發(fā)現(xiàn)DPM 提示該病在胚胎發(fā)育早期就已發(fā)生［9,12］。但是Pacheco 等［5］比較了孤立性BA 與BASM 型患兒DPM的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)兩組之間Kasai術(shù)后自體肝生存率并無差異。有學(xué)者認為DPM 的存在僅能說明膽管分化成熟中斷，不能用來鑒別胚胎期型和圍生期型膽道閉鎖［13］。本研究只有1 例BASM 患兒，Kasai 術(shù)和肝移植時肝組織中都存在DPM，Kasai 早期（術(shù)后163 d）行LT，而非BASM 患兒Kasai術(shù)和肝移植時存在DPM的分別占31%（12/39）和56%（22/39）。結(jié)合既往研究和本研究的結(jié)果，推測DPM 與BASM 可以并行存在，BASM 的患兒可能也存在先天性的膽管發(fā)育不良，所以即使早期行Kasai 手術(shù)預(yù)后仍不佳，需早期行LT 手術(shù)；但DPM 并不是胚胎期型BA 特有的異常改變，DPM 可能發(fā)生在BA 形成的任一過程中。相比于以往研究，本研究BASM患兒數(shù)量較少，可能因BASM患兒胚胎期發(fā)育異常，疾病進展迅速，部分患兒尚未來得及行Kasai手術(shù)，已出現(xiàn)肝硬化等不良結(jié)果，也可能早期已直接行LT。而本研究對象為 先Kasai 后LT 的BA 患 兒，故BASM 所 占 比 例較低。

本研究中Kasai 術(shù)時DPM 比例為32.5%（13/40），LT時為57.5%（23/40），與以往報道的DPM發(fā)生比例基本吻合［4,9,12,14-15］。LT 時DPM 發(fā)生比例相較Kasai術(shù)時明顯升高，分析有以下幾點原因：第一，膽管板的形成和重塑都是由肝門向肝臟外周方向進行的，Kasai 術(shù)時因術(shù)后安全考慮，僅取肝臟右葉外緣的一小塊肝組織，代表性差；第二，LT時在不同部位選取多塊肝組織，具有多個具有大門靜脈管束的斷面可供研究，有較好的代表性；第三，BA是漸進性發(fā)展的疾病，DPM 或者同纖維斑塊一樣，隨著患兒的生長發(fā)育而變化，但這種情況僅僅是筆者的推測，沒有相關(guān)文獻支持。這部分Kasai術(shù)時不存在DPM而LT時出現(xiàn)DPM的患兒，自體肝生存時間不理想。所以筆者認為，Kasai 術(shù)時不存在DPM 的患兒并不一定代表其自體肝生存時間一定長，還要綜合考慮其他影響B(tài)A患兒預(yù)后的因素。

BA 自體肝生存至今仍不理想，Kasai 術(shù)后大多數(shù)患兒仍需LT來挽救生命，當(dāng)前國內(nèi)外專家都在積極研究影響B(tài)A自體肝生存的因素，明確一些提示患兒預(yù)后不良的指標(biāo)，可為早期行LT 做準備。Kasai手術(shù)日齡的選擇可影響B(tài)A患兒長期預(yù)后，手術(shù)日齡較晚的BA患兒肝纖維化程度較重，膽汁淤積時間太長，Kasai術(shù)后肝功能也很難恢復(fù)。但手術(shù)日齡過早也是不可取的，Song 等［16］發(fā)現(xiàn)手術(shù)日齡小于40 d 的BA 患兒預(yù)后較差，分析可能與纖維斑塊尚未形成，肝門處膽管缺乏支撐，膽汁仍引流不暢有關(guān)。另外，肝纖維化程度［17］、BA分型［18］、是否伴發(fā)先天畸形［19］、炎癥細胞浸潤［20］等都可影響B(tài)A患兒的自體肝生存。

Shimadera 等［14］認為存在DPM 的BA 患兒Kasai術(shù)后膽汁引流差，預(yù)后不良。Arii等［15］認為BA患兒伴有DPM 存在時，其Kasai 術(shù)后退黃效果較差。上述研究一致認為DPM的存在并不影響B(tài)A患兒中長期預(yù)后（例如LT）的發(fā)生率。Safwan等［4］的研究表明因診斷太晚來不及行Kasai術(shù)就發(fā)生肝衰竭和Kasai手術(shù)失敗短期內(nèi)行LT 的BA 患兒的DPM 發(fā)生率遠遠高于因Kasai術(shù)后黃疸消退或其他并發(fā)癥而行LT的BA 患兒。本研究結(jié)果表明，無論是Kasai 術(shù)時還是LT 時，有DPM 的BA 患兒自體肝生存時間都明顯縮短。目前DPM 為何會影響B(tài)A 患兒的預(yù)后，機制尚不清楚。筆者推測DPM 的存在預(yù)示著膽管發(fā)育過程中某一環(huán)節(jié)發(fā)生中斷，因此Kasai術(shù)后膽管發(fā)生再次閉塞的可能性較大，最終導(dǎo)致自體肝生存時間不理想。本研究同時發(fā)現(xiàn)2組患兒同時表現(xiàn)出肝纖維化、膽汁淤積膽管增生等病理改變，推測這是BA共同的病理特征，而非DPM 引起；還需要以后進一步研究來闡述DPM影響B(tài)A患兒預(yù)后的機制。在分析資料時，有1 例LT 時有DPM 但Kasai 術(shù)時無DPM的患兒，自體肝生存8年零7 個月后因肝硬化行LT治療，因數(shù)據(jù)偏差太大沒有入組。提示DPM并不是決定膽道閉鎖患兒自體肝生存的唯一決定因素，有DPM只能作為提示預(yù)后不良的指標(biāo)之一。

綜上所述，伴有DPM 的BA 患兒自體肝生存時間明顯縮短，其可作為提示BA患兒預(yù)后不良的一個指標(biāo)。Kasai術(shù)時一旦發(fā)現(xiàn)有DPM，需考慮其可影響自體肝生存時間，如果Kasai 術(shù)后肝功能恢復(fù)不佳，應(yīng)盡早準備肝移植手術(shù)。