桂成坤 林留霞 張晶 宋倩倩 石長(zhǎng)青 王新疆 李蓮瑞,2*

（1 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

（2 塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

（3 第二師二二三團(tuán)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，新疆庫(kù)爾勒841308）

無(wú)漿體（Anaplasma）是一類經(jīng)蜱傳播的專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于牛羊等反芻動(dòng)物的血細(xì)胞中［1］。已知的無(wú)漿體病原包括綿羊無(wú)漿體（A.bovine anaplasm）、中央無(wú)漿體（A. centrale）、牛無(wú)漿體（A.bovine anaplasm）、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體（A. phagocytophilum）和扁平無(wú)漿體（A.platys）［2］。1982 年，在新疆和內(nèi)蒙古無(wú)漿體病被首次報(bào)道［3］。該病可引起動(dòng)物體重下降，流產(chǎn)，產(chǎn)奶量下降，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［4］，鑒于此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須通報(bào)的疫病，也是我國(guó)出入境動(dòng)物檢疫對(duì)象之一［5］。牛無(wú)漿體病可根據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀來(lái)做出初步判斷，然后將牛無(wú)漿體進(jìn)行姬姆薩染色確診。由于血涂片染色法在感染率低或感染早期很難在顯微鏡下檢查出病原，因而需要進(jìn)行分子生物學(xué)診斷。其中PCR 檢測(cè)方法檢出率高，特異性強(qiáng)、敏感性高［6］，但在某些情況下，一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物仍不足以通過(guò)凝膠檢測(cè)觀察到，故本實(shí)驗(yàn)采用巢式PCR 方法。由于無(wú)漿體病的傳播受媒介蜱的影響較大，具有較強(qiáng)的季節(jié)性，6 月份出現(xiàn)，8～10 月流行［7］，因此本次實(shí)驗(yàn)于9 月開(kāi)始采集南疆阿克蘇、和田、喀什和巴州四個(gè)地區(qū)共637 只綿羊的全血樣品，采用巢式PCR法，以16S rRNA基因作為靶基因，對(duì)這些地區(qū)綿羊的牛無(wú)漿體病的流行狀況進(jìn)行調(diào)查。此次實(shí)驗(yàn)可為我國(guó)新疆南疆地區(qū)綿羊牛無(wú)漿體病的診斷和防控提供流行病學(xué)資料。

1 材料

1.1 血液樣品的采集

2016年9月，采集南疆阿克蘇、和田、喀什和巴音郭楞自治州四個(gè)地區(qū)共計(jì)637 只綿羊的抗凝血，于4 ℃保存?zhèn)溆茫瑯悠贩植荚敿?xì)見(jiàn)表1。

表1 南疆四地州綿羊血液采集統(tǒng)計(jì)表

1.2 主要試劑和儀器

試劑：Gold view 染料購(gòu)自蘇州金唯智生物科技有限公司，dNTP Mixture 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，全血DNA 快速提取試劑盒和DL2000 Marker購(gòu)自北京華大生物科技有限公司，Agarose 購(gòu)自北京沃比森科技有限公司。

儀器：凈化工作臺(tái)產(chǎn)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，渦旋混合器產(chǎn)自金壇市醫(yī)療儀器廠，高壓滅菌鍋產(chǎn)自HIPAYAMA 公司，電泳槽產(chǎn)自北京六一儀器廠，凝膠成像系統(tǒng)產(chǎn)自BIO-RAD公司，PCR擴(kuò)增儀產(chǎn)自Biometra公司。

2 方法

2.1 樣品DNA的提取和巢式PCR擴(kuò)增

按照北京華大生物科技有限公司的全血基因組DNA 快速提取試劑盒的說(shuō)明書提取羊全血DNA。參考Kawahara Makoto［8］等人的論文設(shè)計(jì)牛無(wú)漿體的引物序列，牛無(wú)漿體的引物是由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列如表2 所示。其中第一套上游引物為AB1，第一套下游引物為AB2；第二套上游引物為AB3，第二套下游引物為AB4。

表2 牛無(wú)漿體引物序列

巢式PCR 擴(kuò)增體系為：DNA 模板1 μL；上游引物AB1/AB3 和下游引物AB2/AB4 各0. 3 μL；dNTP Mixture 12. 5 μL，加入ddH2O 補(bǔ)至25 μL。第一輪PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。第二輪PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

2.2 感染情況統(tǒng)計(jì)

巢式PCR 擴(kuò)增出目的條帶的樣品為陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性樣品表示綿羊感染牛無(wú)漿體，統(tǒng)計(jì)四個(gè)地區(qū)綿羊牛無(wú)漿體的感染情況。

3 結(jié)果

3.1 巢式PCR電泳結(jié)果

經(jīng)PCR 擴(kuò)增后得到一條551 bp 的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，部分樣品電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 綿羊感染牛無(wú)漿體部分樣品的PCR結(jié)果

3.2 感染結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，喀什地區(qū)的綿羊牛無(wú)漿體感染率為55. 3%，各縣、市綿羊的牛無(wú)漿體感染情況如表3 所示；巴州地區(qū)的感染率

為43. 3%，各縣、市綿羊的牛無(wú)漿體感染情況如表4 所示；和田地區(qū)的感染率為53. 3%，各縣、市綿羊的牛無(wú)漿體感染情況如表5 所示；阿克蘇地區(qū)的感染率為51.3%，各縣、市綿羊的牛無(wú)漿體感染情況如表6所示。

表3 喀什地區(qū)綿羊的牛無(wú)漿體感染情

表4 巴州地區(qū)綿羊的牛無(wú)漿體感染情

表5 和田地區(qū)綿羊的牛無(wú)漿體感染情

表6 阿克蘇地區(qū)綿羊的牛無(wú)漿體感染情

4 討論

巢式PCR 檢測(cè)方法，敏感度高、特異性強(qiáng)，是目前檢測(cè)和診斷羊無(wú)漿體病的較為普遍的方法。16S rRNA 基因具有一定的保守性，根據(jù)MSP4 基因和16S rRNA 基因設(shè)計(jì)、合成引物，選擇巢式PCR 方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果更精準(zhǔn)有效。

牛無(wú)漿體的傳播媒介主要是鈍緣蜱、扇頭蜱、璃眼蜱和血蜱等幾個(gè)屬，由表6可知溫宿縣綿羊牛無(wú)漿體的感染率高達(dá)81.8%，是所有縣市中感染率最高的縣，這與劉永宏調(diào)查的溫宿縣蜱的流行情況相吻合，據(jù)劉永宏［9］調(diào)查結(jié)果顯示該地方主要流行的蜱是鈍緣蜱、扇頭蜱屬，但其他蜱屬均有發(fā)現(xiàn)，并且該地方的蜱密度高，綿羊感染率高，所以該地方的綿羊牛無(wú)漿體的感染率也非常高。

喀什地區(qū)的12 個(gè)縣、市綿羊的牛無(wú)漿體的總陽(yáng)性率為55.3%，是四個(gè)地區(qū)中感染率最高的地區(qū)，根據(jù)劉永宏［9］調(diào)查結(jié)果喀什地區(qū)羊蜱優(yōu)勢(shì)屬類為璃眼蜱屬和鈍緣蜱屬，都是牛無(wú)漿體的主要傳播媒介，并且喀什地區(qū)的養(yǎng)殖技術(shù)落后和非規(guī)?；酿B(yǎng)殖模式居多，防疫工作較難落實(shí)，導(dǎo)致該地區(qū)的蜱蟲(chóng)感染率高，使得牛無(wú)漿體的感染率處于較高水平；并且可以看出，沿葉爾羌河流域的周邊幾個(gè)縣的感染率都比較高，因?yàn)樵摰貐^(qū)水草豐茂，有利于蜱的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)一步加劇了牛無(wú)漿體的感染。

和田策勒縣的感染率為53.3%，在和田地區(qū)只采取這一個(gè)縣的樣品故和田地區(qū)的感染率數(shù)據(jù)尚不完善。劉永宏［9］調(diào)查結(jié)果顯示和田地區(qū)策勒縣羊蜱優(yōu)勢(shì)屬類為扇頭蜱屬和血蜱屬，也是牛無(wú)漿體的主要傳播媒介，所以該縣的感染率也達(dá)到50%以上。

巴州地區(qū)綿羊的牛無(wú)漿的總體感染率為43.3%，相比較喀什及和田地區(qū)的感染率要低很多，因?yàn)樵摰貐^(qū)相較于喀什和和田地區(qū)得養(yǎng)殖技術(shù)相對(duì)先進(jìn)，養(yǎng)殖模式也相對(duì)集約化規(guī)?；?，蜱蟲(chóng)的防控工作也相對(duì)完善。

新疆南疆綿羊的牛無(wú)漿體的總體感染率為52.9%，在新疆南疆地區(qū)不同的地區(qū)綿羊的牛無(wú)漿體感染率不相同，同一地區(qū)不同的縣、市綿羊的牛無(wú)漿體的感染率也各不相同，通過(guò)代艷艷［10］人對(duì)新疆南疆地區(qū)牛羊寄生蜱類調(diào)查可知至少有數(shù)十種以上的蜱可引起動(dòng)物的牛無(wú)漿體病發(fā)生，其中能使羊發(fā)生牛無(wú)漿體病的蜱主要有扇頭硬蜱、草原革蜱、璃眼蜱等，而在新疆南疆地區(qū)的羊的硬蜱科主要有八個(gè)屬，軟蜱科主要有兩個(gè)屬，其中扇頭蜱屬和璃眼蜱屬在新疆南疆地區(qū)存在最多。聞秀秀［11］等調(diào)查可確定銀盾革蜱及邊緣革蜱為無(wú)漿體的媒介蜱。由于新疆南疆地區(qū)的氣候干燥，夏季溫度較高，適宜蜱的生長(zhǎng)，蜱類在新疆南疆各個(gè)地區(qū)都有存在，且蜱類存在的種類和數(shù)量沒(méi)有較大的差異，故新疆南疆綿羊的牛無(wú)漿體在各個(gè)地區(qū)都有感染。張菲菲［12］等應(yīng)用PCR檢測(cè)法對(duì)中國(guó)河南、內(nèi)蒙、遼寧、山西、山東、云南綿羊和山羊血液樣品進(jìn)行無(wú)漿體檢測(cè)，結(jié)果表明牛無(wú)漿體的感染率為30.15%。遲慶安［6］等研究的調(diào)查結(jié)果顯示，四川省、重慶市、云南省、貴州省、湖南省、廣西壯族自治區(qū)、廣東省七?。▍^(qū)、市）牛無(wú)漿體陽(yáng)性率分別為17.5%、25.7%、29.6%、59.1%、8.2%、14.0%和23.7%，總體陽(yáng)性率為25.1%。而新疆南疆地區(qū)的感染率為52.9%，較我國(guó)中東部地區(qū)和南方七省感染率高出許多。

無(wú)漿體病對(duì)養(yǎng)羊業(yè)危害較大，綿羊感染無(wú)漿體病后多引起增重緩慢，飼料報(bào)酬降低，流產(chǎn)，病情轉(zhuǎn)急發(fā)作時(shí)也會(huì)造成死亡，給綿羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，可引起人和動(dòng)物貧血、黃疸、膽囊腫大、消瘦等臨床癥狀，應(yīng)該重視此病。本病的防治原則主要是切斷傳播途徑，加強(qiáng)驅(qū)蜱滅蜱等蜱蟲(chóng)防控工作，避免易感動(dòng)物被蜱等傳播媒介叮咬，增強(qiáng)易感動(dòng)物的免疫力等。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了新疆南疆地區(qū)綿羊的牛無(wú)漿體的流行病學(xué)資料，并為南疆四地州的綿羊的牛無(wú)漿體病的防控提供參考數(shù)據(jù)。