劉東鑫 鄭惠文 賀文從 宋怡蒙 何萍 趙冰 歐喜超 劉春法 趙雁林

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)是指除了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌之外的一類(lèi)分枝桿菌，廣泛存在于各種自然環(huán)境中，目前共發(fā)現(xiàn)170余種[1]。NTM在人群中的致病性普遍較低，但能引起多種疾病，尤其是在HIV感染及免疫缺陷患者中。近年來(lái)，與NTM相關(guān)的疾病發(fā)病率明顯增加[1]；基于一項(xiàng)人口流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)表明，NTM在所有分枝桿菌患者中的分離率從1990年的4.2%增加到了2010年的22.9%，引起了廣泛關(guān)注[2]。目前，由于國(guó)內(nèi)外對(duì)NTM肺病的診斷治療標(biāo)準(zhǔn)尚缺乏共識(shí)[3]，且臨床上發(fā)現(xiàn)的NTM感染多為支氣管擴(kuò)張和慢性阻塞性肺疾病患者的并發(fā)感染，治療藥物的選擇和療程均缺乏相應(yīng)的指南和專(zhuān)家共識(shí)，常常難以完全根治；另外，NTM肺病的臨床癥狀、X線(xiàn)表現(xiàn)與肺結(jié)核相似[4]，但治療方案差別明顯，臨床上多造成誤診誤治，使得患者病程遷延[5]。因此，早期菌種鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果對(duì)于NTM肺病的正確診斷及合理治療至關(guān)重要。本研究通過(guò)分析2016年廣州市胸科醫(yī)院搜集的717株培養(yǎng)陽(yáng)性的分枝桿菌臨床分離株的菌種鑒定和 NTM藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，為臨床診斷和治療NTM病提供依據(jù)。

材料和方法

一、一般情況

1.菌株培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)：從2016年廣州市胸科醫(yī)院經(jīng)BACTEC MGIT 960系統(tǒng)培養(yǎng)的1250份標(biāo)本中搜集培養(yǎng)陽(yáng)性的717株分枝桿菌臨床分離株，分別接種于羅氏培養(yǎng)基(L-J培養(yǎng)基)、水溶性對(duì)硝基苯甲酸(pnitrobenzoic acid, PNB)培養(yǎng)基和噻吩-2-羧酸肼 (2 thiophene carborylic acid hydrazide，TCH) 培養(yǎng)基，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)4周后對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與NTM進(jìn)行區(qū)分，菌落生長(zhǎng)情況的判讀結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)PNB和TCH均陽(yáng)性的分離株采用多個(gè)靶基因位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)測(cè)序進(jìn)一步行NTM菌種鑒定，對(duì)鑒定為NTM不同菌種的菌株以最低抑菌濃度法 (minimal inhibitory concentration，MIC)進(jìn)行18種抗生素的藥敏試驗(yàn)。

表1 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和NTM采用L-J、PNB和TCH培養(yǎng)基鑒定結(jié)果的比較

注L-J培養(yǎng)基為羅氏培養(yǎng)基；PNB培養(yǎng)基為對(duì)硝基苯甲酸培養(yǎng)基；TCH培養(yǎng)基為噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基；a:為牛分枝桿菌的TCH實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的其他菌種，單獨(dú)顯示

2.菌株和試劑：MTB對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)由國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。NTM參考株來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所和美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)等。L-J、PNB和TCH鑒別培養(yǎng)基均由本院實(shí)驗(yàn)室按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]的要求配制。PCR預(yù)混液—2×Taq Master Mix、DNA標(biāo)準(zhǔn)片段—100 bp DNA Ladder和瓊脂糖均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；氣相色譜緩沖液Ⅰ(GC buffer I)、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和Taq酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

二、研究方法

1. DNA提?。簭腖-J固體培養(yǎng)基斜面上刮取1接種環(huán)3～4周的新鮮實(shí)驗(yàn)菌株，重懸于400 μl TE緩沖液(pH 8.3)中，100 ℃煮沸15 min，離心半徑13.5 cm，12 000 r/min離心10 min，取上清用做基因測(cè)序模板液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 多靶位基因PCR擴(kuò)增：根據(jù)文獻(xiàn)操作步驟合成16S rRNA[7]、rpoB[8]、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers，ITS)和hsp65[9]特異性引物，引物序列及產(chǎn)物見(jiàn)表2。20 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×Taq MasterMix 10 μl，上下引物各0.4 μl(10 μM)，1.4 μl模板液，雙蒸水(ddH2O)7.8 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30個(gè)循環(huán)，最終72 ℃充分延伸10 min。結(jié)果檢測(cè)：取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，在1%瓊脂糖(含 GelRed核酸染料)凝膠上電泳(電壓 100 V，100～150 min)，用100 bp DNA Ladder來(lái)確定相對(duì)分子質(zhì)量的大小，以標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為對(duì)照。

表2 多靶位基因擴(kuò)增引物

3. 序列測(cè)序及同源性比對(duì)：經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用BLAST軟件，將測(cè)序得到的基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列作比對(duì)分析，序列結(jié)果與網(wǎng)上序列相似性≥97%時(shí)，可判定為該菌種。

4. 藥敏試驗(yàn)：參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)[10]《M24-A2指南》標(biāo)準(zhǔn)，采用微孔板Alamar-Blue法檢測(cè)菌種鑒定為NTM的菌株對(duì)18種抗生素的MIC值，抗生素的藥物信息、藥物儲(chǔ)存液配制濃度、藥敏板中最小及最大藥物濃度見(jiàn)表3。刮取L-J培養(yǎng)基上處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌株，將配菌液濃度配成0.5麥?zhǔn)媳葷峁芎螅?0 μl濃度為0.5 麥?zhǔn)蠞岫葐挝?MCF)的菌液加入到10 ml含5%OADC增菌液的陽(yáng)離子調(diào)節(jié)肉湯(caton-adjusted mueller-hnton broth, CAMHB)培養(yǎng)基中，以制備最終接種液[菌體濃度約為7.5×105菌落形成單位(CFU)/ml]，顛倒混勻。將藥物加入到含有100 μl的 CAMHB培養(yǎng)基96孔板的第1列，倍比稀釋后加入100 μl稀釋后的菌液，最后1列為不含藥液的陽(yáng)性對(duì)照。24 h后在第1孔無(wú)藥培養(yǎng)基中加入70 μl指示劑(20 μl Alamar Blue指示劑+50 μl 經(jīng)高壓滅菌的5%吐溫-80)，孵育24 h后如果培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，則在所有含藥培養(yǎng)基中加入指示劑，分別于3 d內(nèi)和7 d內(nèi)觀(guān)察快生長(zhǎng)分枝桿菌和慢生長(zhǎng)分枝桿菌的生長(zhǎng)情況。變色孔最低濃度與不變色孔最高濃度所對(duì)應(yīng)的藥物濃度范圍為MIC值，藥物的藥敏試驗(yàn)臨界值參照CLSI《M24-A2指南》標(biāo)準(zhǔn)(表4)，對(duì)于《M24-A2指南》中沒(méi)有藥敏試驗(yàn)臨界值的藥物，可參照其他菌種的臨界值，其中阿奇霉素和替加環(huán)素的藥敏試驗(yàn)臨界值可參考氯法齊明的臨界值[11-12]，左氧氟沙星和加替沙星參考莫西沙星的藥敏試驗(yàn)臨界值。

表3 18種抗生素對(duì)NTM作用的濃度范圍

注DMSO：二甲基亞砜；藥物的藥敏試驗(yàn)臨界值參照CLSI《M24-A2指南》標(biāo)準(zhǔn)[10]，阿奇霉素和替加環(huán)素的藥敏試驗(yàn)臨界值可參考氯法齊明的臨界值，左氧氟沙星和加替沙星參考莫西沙星的藥敏試驗(yàn)臨界值

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)<5時(shí)進(jìn)行Fisher確切概率檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 NTM各類(lèi)菌種對(duì)CLSI《M24-A2指南》中不同藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果的臨界值

注CLSI為“美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute)”；“-”表示沒(méi)有確定值

結(jié) 果

1. NTM菌株初步鑒定結(jié)果：717株分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)菌株中，106株在PNB和TCH鑒別培養(yǎng)基上均有分枝桿菌生長(zhǎng)，初步判定為NTM，檢出率為14.4%。

2. 多靶位基因鑒定結(jié)果：106株NTM臨床分離株中，103株傳代成功，傳代率為97.2%。經(jīng)多靶位基因PCR擴(kuò)增菌種鑒定后顯示，前3位的NTM菌種依次為膿腫分枝桿菌(34.0%)、胞內(nèi)分枝桿菌(25.2%)和馬賽分枝桿菌(20.4%)。另外有3株NTM菌株臨床少見(jiàn)，分別為1株緩黃分枝桿菌和1株豬分枝桿菌和1株阿加普爾分枝桿菌。具體見(jiàn)表5。

3. NTM的藥敏試驗(yàn)結(jié)果：103株NTM菌株因3株無(wú)臨床意義的罕見(jiàn)臨床菌株及2株偶發(fā)分枝桿菌的菌株量過(guò)少，為避免偶然因素引起藥敏試驗(yàn)結(jié)果偏性，未進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。最終納入98株NTM菌株對(duì)18種抗生素行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示NTM對(duì)克拉霉素(91.8%)、阿米卡星(93.9%)和阿奇霉素(71.4%)的敏感率最強(qiáng)，而對(duì)利福平、左氧氟沙星、亞胺培南的耐藥率最高(分別為89.8%，83.7%，77.6%)，且對(duì)除克拉霉素和阿米卡星以外的其他16種抗生素的耐藥率均在32.7%以上。具體見(jiàn)表6。且98株NTM菌株對(duì)18種抗生素敏感率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=373.75,P<0.001)。

表5 103株傳代成功的NTM菌種的分布情況

注其他分枝桿菌包括1株緩黃分枝桿菌、1株豬分枝桿菌、1株阿加普爾分枝桿菌

表6 98株NTM菌株對(duì)18種抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表7 18種抗結(jié)核藥物在不同NTM菌種間藥敏試驗(yàn)結(jié)果的分布情況

注括號(hào)外數(shù)值為“菌株株數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“構(gòu)成比(%)”；“-”為理論頻數(shù)<5，采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)

4.不同的NTM菌種對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥率的種間差異：98株藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，膿腫分枝桿菌、馬賽分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌對(duì)克拉霉素和阿米卡星的藥物敏感率均在80%以上，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.341，P=0.161)。而阿奇霉素、替加環(huán)素、頭孢西丁對(duì)膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌的藥物敏感率高于鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌以及堪薩斯分枝桿菌。由此可見(jiàn)，快生分枝桿菌和慢生分枝桿菌對(duì)克拉霉素和阿米卡星的耐藥率均較低，而慢生分枝桿菌對(duì)阿奇霉素、替加環(huán)素及頭孢西丁的耐藥率明顯高于快生分枝桿菌。各菌種耐藥情況見(jiàn)表7。

討 論

NTM病通常屬于機(jī)會(huì)性感染，與MTB相比，NTM的毒力和致病性較低。既往NTM病一直被認(rèn)為是少見(jiàn)病甚至是罕見(jiàn)病，但是近年來(lái)隨著人口老齡化、免疫抑制人群的增加、細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，以及分子鑒定方法的發(fā)展等原因，NTM病的發(fā)病呈明顯增多趨勢(shì)，提示我國(guó)應(yīng)高度重視NTM的感染情況[2]。其中NTM的菌種鑒定是目前人們研究的重要方向，這對(duì)于了解相關(guān)地區(qū)NTM的菌種分布及疾病防控有重要意義。此外，多數(shù)NTM對(duì)抗結(jié)核藥物具有天然耐藥性，治療可用藥物有限。因此，有效的區(qū)分NTM和MTB復(fù)合群，以及進(jìn)行合理的藥敏試驗(yàn)均有利于NTM病的正確診斷和有效治療。

快速準(zhǔn)確的鑒定NTM是診斷和研究NTM病的重要基礎(chǔ)。TCH和PNB培養(yǎng)是基層鑒定MTB和NTM的主要實(shí)驗(yàn)室方法，有文獻(xiàn)報(bào)道98%～100%的MTB復(fù)合群在含500 μg/ml PNB的羅氏培養(yǎng)基上不能夠生長(zhǎng)[13]；而NTM中除個(gè)別菌種或個(gè)別菌種的少量菌株外，均能耐受500 μg/ml的PNB，在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。由此可見(jiàn)，該方法可以有效區(qū)分MTB復(fù)合群和NTM，為診斷和進(jìn)一步的治療提供一定的理論依據(jù)。由于該方法不能將NTM鑒定到種屬，因此僅作為一種初篩方法。如需進(jìn)一步確定NTM的具體種屬，則需行PCR測(cè)序確認(rèn)。本研究中717株分枝桿菌中有106株在PNB和TCH鑒別培養(yǎng)基上均有分枝桿菌生長(zhǎng)，初步鑒定為NTM，NTM檢出率明顯高于我國(guó)其他地區(qū)[14-15]。有研究報(bào)道，膿腫分枝桿菌常與潮濕和高溫環(huán)境有關(guān)[16]，所以在中國(guó)南部的流行率較高。本研究利用多靶位基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在廣州地區(qū)最常見(jiàn)的分枝桿菌是膿腫分枝桿菌(34.0%)，高于臺(tái)灣[17]的30.2%和北京地區(qū)[18]的29.5%；考慮可能與其在不同地域分布及不同氣候環(huán)境的發(fā)病率不同有關(guān)；本研究還發(fā)現(xiàn)，廣州地區(qū)胞內(nèi)分枝桿菌位居第二(25.2%)，低于北京地區(qū)[19](39.20%)和中國(guó)東部[20](68.33%)，其分離率的高低可能與其在環(huán)境中的廣泛分布，尤其是在飲用水中的分布廣泛有關(guān)。

NTM病可治療用藥有限，且藥物相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率高，并伴隨耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果并不理想。美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(American Thoracic Society，ATS)和美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)(Infectious Diseases Society of America，IDSA)建議NTM病在治療前應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以利于指導(dǎo)臨床用藥[3]。本研究選取了18種抗結(jié)核藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，以期從這些藥物中了解到本地區(qū)治療NTM常用藥物的耐藥現(xiàn)狀，并尋找出對(duì)NTM病有治療潛力的新藥。本研究發(fā)現(xiàn)，不同NTM菌種及NTM總體均對(duì)克拉霉素和阿米卡星的藥物敏感率高，而NTM對(duì)利福平等傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物的耐藥率高達(dá)89.8%，對(duì)臨床常用藥物左氧氟沙星的耐藥率也高達(dá)83.7%，提示相對(duì)于利福平、左氧氟沙星等藥物，克拉霉素和阿米卡星是臨床治療NTM患者的優(yōu)選抗生素，同時(shí)也提示應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)MTB復(fù)合群和NTM的鑒別診斷，以避免誤診誤治，延誤病情。

同時(shí)，NTM不同種屬間對(duì)藥物的耐藥情況存在著種間耐藥藥物的種類(lèi)不同、耐藥率高低不等的差異。鳥(niǎo)胞內(nèi)分枝桿菌是對(duì)人類(lèi)最主要的致病性NTM菌種，常引起鳥(niǎo)胞內(nèi)分枝桿菌肺病或淋巴炎。目前對(duì)于未經(jīng)治療的鳥(niǎo)胞內(nèi)分枝桿菌肺病患者，僅推薦進(jìn)行克拉霉素的體外藥敏檢測(cè)，臨床治療中則推薦包含克拉霉素或阿奇霉素在內(nèi)的至少2種以上的抗生素進(jìn)行聯(lián)合治療[21]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了鳥(niǎo)分枝桿菌對(duì)克拉霉素敏感率最高。此外，雖然利福平和利福布汀均屬于利福霉素類(lèi)藥物，但本研究顯示，鳥(niǎo)分枝桿菌對(duì)利福布汀的敏感率高于利福平，可能與利福布汀對(duì)肝臟細(xì)胞色素P450-3A系統(tǒng)的誘導(dǎo)作用相對(duì)于利福平較弱，更適合用于HIV感染并發(fā)鳥(niǎo)分枝桿菌肺病的患者有關(guān)[21]。膿腫分枝桿菌在致病性NTM中占有非常重要的地位，《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)》[22]認(rèn)為其對(duì)克拉霉素、阿米卡星、頭孢西丁敏感，對(duì)利奈唑胺、替加環(huán)素、亞胺培南和氯法齊明等中度敏感。本研究結(jié)果顯示，35株膿腫分枝桿菌對(duì)阿米卡星和克拉霉素的敏感率最高，而對(duì)利福平和乙胺丁醇的耐藥率最高，與上述研究基本一致。而21株馬賽分枝桿菌對(duì)阿米卡星、阿奇霉素和克拉霉素的敏感率最高，而對(duì)利福平、卷曲霉素和乙胺丁醇的敏感率均低于10%。膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌均對(duì)乙胺丁醇的耐藥率較高，可能與兩種菌種均能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的屏障功能，間接增強(qiáng)了其他藥物的作用有關(guān)，故《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)》仍建議將二者作為次選藥物與克拉霉素或者阿奇霉素聯(lián)用[22]。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物中的克拉霉素和氨基糖苷類(lèi)藥物中的阿米卡星對(duì)所有NTM的體外活性均為最強(qiáng)(敏感率均為80%以上)，與之前的研究結(jié)果一致[23-25]，可能與藥物本身的性質(zhì)如脂溶性的大小、進(jìn)入菌體的方式以及菌體表面有無(wú)外排泵等因素相關(guān)。而對(duì)于四環(huán)素類(lèi)藥物，本研究顯示，替加環(huán)素對(duì)快生長(zhǎng)分枝桿菌(如膿腫分枝桿菌)的抗菌效果優(yōu)于慢生長(zhǎng)分枝桿菌(如鳥(niǎo)胞內(nèi)分枝桿菌)，提示替加環(huán)素對(duì)于快生長(zhǎng)分枝桿菌具有潛在的活性，不適用于慢生長(zhǎng)分枝桿菌的臨床治療，與“替加環(huán)素對(duì)任一慢生長(zhǎng)分枝桿菌均沒(méi)有活性”[26]的文獻(xiàn)報(bào)道相一致。文獻(xiàn)報(bào)道指出，在所有氟喹諾酮類(lèi)藥物中，左氧氟沙星與莫西沙星在治療結(jié)核病方面效果相當(dāng)[27]，但在治療NTM病方面，左氧氟沙星的效果遠(yuǎn)不如莫西沙星[28]，與本研究的結(jié)果一致。另外，有學(xué)者認(rèn)為，即使莫西沙星體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示耐藥，也建議與克拉霉素一起使用，由于莫西沙星口服吸收好，患者服用方便，依從性會(huì)好，臨床上是一種好的治療選擇[29]；此外，莫西沙星不經(jīng)細(xì)胞色素P450酶代謝，減少了藥物間互相作用的可能性，與其他抗生素聯(lián)合使用可以降低耐藥發(fā)生的概率。目前，已經(jīng)有長(zhǎng)期口服莫西沙星治愈膿腫分枝桿菌復(fù)合群肺病的病例報(bào)道[30]。

本研究也有一定的局限性，一是本研究的菌株均來(lái)自于廣州市胸科醫(yī)院，未對(duì)廣州市其他醫(yī)院的菌株進(jìn)行分析；二是本研究?jī)H分析了菌株的耐藥特點(diǎn)，但未對(duì)耐藥菌株進(jìn)行耐藥基因突變的分析，未闡明菌株的耐藥機(jī)制；三是本研究未對(duì)幾種新藥的耐藥性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

綜上，建議臨床用藥前應(yīng)盡量進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)以指導(dǎo)臨床用藥，對(duì)已經(jīng)診斷為NTM的菌株，應(yīng)根據(jù)菌種類(lèi)型選擇更多的可能敏感藥物進(jìn)行篩查；同時(shí)，也迫切需要發(fā)現(xiàn)新的抗NTM藥物，以提高NTM病的治愈率。