汪建業(yè) 趙之聰 侯嘉杰 夏強(qiáng)

趨化因子在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，例如白細(xì)胞轉(zhuǎn)移、免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖等[1，2]。近年來，趨化因子在肝癌中的作用受到廣泛關(guān)注，它們一方面可以募集免疫細(xì)胞增強(qiáng)免疫反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用，另一方面也可以促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲。CCL23(又稱MPIF-1，MIP-3或CKβ-8)基因位于染色體17q12，最早是從人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞和人單核細(xì)胞系THP-1中發(fā)現(xiàn)的，在多種組織中表達(dá)，包括闌尾，結(jié)腸和膽囊等。它通過受體CCR1對單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞具有趨化活性，并對粒-單核系祖細(xì)胞的增殖具有抑制作用[3-5]，但CCL23在惡性腫瘤中的作用鮮有報(bào)道。本研究從公用數(shù)據(jù)庫中篩選出在肝癌和癌旁肝組織中表達(dá)差異明顯的CCL23，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法進(jìn)一步驗(yàn)證CCL23在肝癌組織中的表達(dá)。

資料和方法

一、基于肝細(xì)胞癌的數(shù)據(jù)分析

通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載公共肝癌芯片數(shù)據(jù)(GSE14520，GSE25097，GSE57957，GSE57958，GSE64041)，TCGA-LIHC數(shù)據(jù)庫獲取(http://tcgadata.nci.nih.gov)374例肝癌及50例正常肝組織基因表達(dá)譜，通過Perl語言生成“基因表達(dá)矩陣文件”，并分析相關(guān)基因變化。

二、臨床樣本選取及隨訪

收集2014年2月至2016年2月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院的196例行根治性肝切除術(shù)的肝癌患者組織標(biāo)本及臨床病理資料，并制作肝癌組織芯片。另外隨機(jī)選擇82個(gè)HCC組織標(biāo)本，同時(shí)選取配對的癌旁正常組織標(biāo)本。肝癌組織選擇：①術(shù)前臨床診斷為原發(fā)性肝癌及術(shù)后病理確診為肝細(xì)胞肝癌；②臨床病理資料完整；③癌旁正常組織距肝癌組織>2 cm。④排除非腫瘤原因死亡者。術(shù)后以門診和電話形式進(jìn)行隨訪，從手術(shù)日開始計(jì)算存活時(shí)間和無復(fù)發(fā)存活時(shí)間。

三、免疫組織化學(xué)

將組織芯片脫蠟，水合，通過檸檬酸鹽抗原修復(fù)溶液(用PBS稀釋)在微波條件下修復(fù)，CCL23單克隆抗體(英國Abcam公司，ab171751)以1∶100稀釋，并用1%BSA稀釋為陰性對照，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的二抗(購自美國Jackson公司)以1∶200稀釋。染色評估：使用Image pro plus 軟件讀取圖像IA值，并根據(jù)IA值來評價(jià)肝組織中的CCL23的表達(dá)強(qiáng)度。

四、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

隨機(jī)選擇82對癌與癌旁組織。根據(jù)Biotech RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的脫氧核糖核酸(cDNA)。Nanodrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)測量RNA濃度及純度，并根據(jù)SYBR Green I Master Mix方案，反應(yīng)體系10 μL，β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。 PCR：95℃ 5 min; 95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán); 95℃，5 s，65℃，1 min。引物序列為： CCL23正向引物：5′-CATCT-CCTACACCCCACGAAG-3′，反向引物：5′-GGGT-TGGCACAGAAACGTC-3′；β-actin正向引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACAT-TAAG-3′，β-actin反向引物：5′-TGTGTTGGCGTA-CAGGTCTTTG-3′。

五、統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 7.0或SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。配對t檢驗(yàn)用于分析肝癌及癌旁組織中CCL23表達(dá)的差異，Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)用于生存分析，單因素和多因素Cox回歸模型用于分析CCL23表達(dá)水平對于預(yù)后的影響，卡方檢驗(yàn)用于分析CCL23表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同趨化因子在肝癌中的表達(dá)

為了篩選出在肝癌發(fā)展中起重要作用的趨化因子，研究了GSE25097隊(duì)列以及TCGA中所有趨化因子基因的表達(dá)譜，將配對肝癌和癌旁的表達(dá)譜進(jìn)行差異表達(dá)分析，結(jié)果顯示，與正常組織相比，GSE14520及TCGA數(shù)據(jù)庫中分別有35、38種趨化因子基因表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)。見表1。在這兩個(gè)隊(duì)列中，除去CXCL14后(其在數(shù)據(jù)庫中對患者總體預(yù)后影響并不明顯)，CCL23的差異倍數(shù)(foldchange, FC)及差異的顯著性變化都最為明顯(TCGA：FC=0.132873932,P值=2.31217E-88; GSE25097：FC=0.130784185,P值=1.15E-72)。

二、CCL23在公共數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)、與臨床病理相關(guān)性及患者預(yù)后的關(guān)系

進(jìn)一步驗(yàn)證隊(duì)列(GSE57957，GSE64041)發(fā)現(xiàn)CCL23在肝癌組織中的表達(dá)普遍下調(diào)(所有數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理)(圖1 A)。在TCGA以及GSE14520隊(duì)列中，將患者分為高表達(dá)和低表達(dá)組，并繪制Kaplan-Meier曲線，結(jié)果提示，CCL23高表達(dá)組的總體生存率(TCGA：P=0.0026，GSE14520：P=0.0014)(圖2 B)和無復(fù)發(fā)生存率(TCGA：P=0.0306，GSE14520：P=0.0189)(圖1 C)均顯著延長。其與臨床病理指標(biāo)構(gòu)建四個(gè)表并做卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝癌中的CCL23表達(dá)水平僅與腫瘤數(shù)目(P=0.019)明顯相關(guān)。此外，在GSE14520隊(duì)列中，通過單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)，CCL23表達(dá)水平(P=0.002)、肝硬化(P=0.020)和BCLC分期(P<0.01)是總生存時(shí)間的影響因素，而CCL23表達(dá)水平(P<0.01)和性別(P=0.024)是影響肝癌患者無瘤生存時(shí)間的影響因素。見表2，3。

表1 公共數(shù)據(jù)庫中趨化因子基因差異表達(dá)

三、CCL23在肝癌患者中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系

通過qRT-PCR對82例肝癌及配對癌旁組織中進(jìn)一步驗(yàn)證CCL23 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示肝癌組織中CCL23表達(dá)明顯低于癌旁組織(P<0.01)(圖2 A)。此外，通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在已有的70對癌和癌旁肝組織芯片中，CCL23陽性強(qiáng)度明顯高于癌旁組織(圖2 D)。根據(jù)染色強(qiáng)度，將肝癌組織中CCL23分為高表達(dá)(n=97)和低表達(dá)(n=99)兩組，結(jié)果顯示，CCL23高表達(dá)者的總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間上都明顯優(yōu)于CCL23低表達(dá)的患者(P<0.01)(圖2 B&C)；與各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)構(gòu)建四格表并做卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝癌中的CCL23表達(dá)水平與病理分級(P=0.003)明顯相關(guān)，而與年齡、性別、HBV、腫瘤大小甲胎蛋白、腫瘤數(shù)目、ALT、衛(wèi)星病灶及肝硬化無關(guān)(表4)。另外，將各項(xiàng)病理指標(biāo)分別做單因素COX回歸分析，然后將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中CCL23水平(P=0.002)、腫瘤大小(P<0.01)、腫瘤數(shù)目(P=0.005)和甲胎蛋白(P=0.041)是影響肝癌患者術(shù)后總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而CCL23水平(P<0.01)、腫瘤大小(P<0.001)和甲胎蛋白(P=0.015)是影響肝癌患者術(shù)后無瘤生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表5)。

表2 GSE14520中CCL23和臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性

注：A.在公共數(shù)據(jù)庫中，CCL23在肝癌與癌旁組織中的差異；B.在 TCGA-LIHC隊(duì)列； C.GSE14520隊(duì)列中，肝癌組織中CCL23表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

圖1CCL23在公共數(shù)據(jù)中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系

注：A.82例肝癌患者中，CCL23在肝癌與癌旁組織中的差異； B和C.肝癌組織中的CCL23高表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系； D.CCL23在肝組織中的免疫組織化學(xué)染色(左：肝癌組織；右：配對癌旁組織：左上：肝癌組織中的CCL23低表達(dá)患者；左下：肝癌組織中CCL23高表達(dá)患者，放大倍數(shù)：200倍)

圖2 CCL23在肝癌患者中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系

注：NA為未被采納

表4 HCC中CCL23和臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性

討 論

目前已經(jīng)在多種疾病中發(fā)現(xiàn)趨化因子的重要作用，尤其是在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中。例如，Zhang等[6]分析人肝癌的預(yù)后生物標(biāo)志物的微陣列發(fā)現(xiàn)，CCL14明顯下調(diào)，并且對肝癌細(xì)胞增殖有影響。Wang等[7]通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)多個(gè)趨化因子是肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其中XCR1對肝癌患者預(yù)后影響最顯著。此外，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中，趨化因子配體-受體的相互作用發(fā)揮著重要作用，例如CXCL12-CXCR4/CXCR7可以促進(jìn)肝癌的增殖[8，9]，CX3CL1-CX3CR1可抑制肝癌細(xì)胞的增殖[10]，CCL20可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力等[11]。

本研究首先在GSE14520隊(duì)列探討各個(gè)趨化因子在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)水平，然后在其他公共數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，CCL23的表達(dá)差異最為顯著。已知CCL23可以特異性募集靜息T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞、抑制髓系祖細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管形成，還可以負(fù)性調(diào)節(jié)人臍帶血CD34+細(xì)胞的增殖等[12]。本研究證實(shí)了CCL23在肝癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤數(shù)目及病理分級相關(guān)，提示其可能參與腫瘤細(xì)胞的分化和增殖，其中高表達(dá)者的總生存時(shí)間及無瘤生存時(shí)間顯著延長，表明CCL23可能抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。此外，CCL23與其受體CCR1結(jié)合，可以募集單核細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，并且可通過CCR1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成，但CCL15-CCR1軸可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13]、CCL3-CCR1軸可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲[14]，表明在肝癌中CCL23可能不是主要通過CCR1發(fā)揮作用。綜上所述，趨化因子CCL23可以作為肝癌術(shù)后遠(yuǎn)期生存復(fù)發(fā)的預(yù)測指標(biāo)，為今后的肝癌治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

表5 HCC中CCL23的單因素和多因素Cox回歸分析