周鉞，李鍵，張玉，王洪偉，趙欣，劉士健，索化夷*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都，610041) 3(重慶第二師范學(xué)院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，400067)

發(fā)酵乳品源于我國(guó)游牧民族，多以牛羊駝馬等動(dòng)物乳為原料，涉及多種微生物共棲生長(zhǎng)，發(fā)酵形成獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)和功能成分，同時(shí)延長(zhǎng)乳品的保質(zhì)期[1]。區(qū)別于現(xiàn)代發(fā)酵方式，傳統(tǒng)發(fā)酵沒有固定的發(fā)酵“起子”，發(fā)酵過程更加復(fù)雜多樣。表1歸納了不同類型的傳統(tǒng)發(fā)酵乳品及發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種[2-3]，發(fā)酵乳品中微生物群落存在個(gè)體代謝和復(fù)雜的相互作用，微生態(tài)的多樣性和行為差異無(wú)法保證最終發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)穩(wěn)定和安全[4]。為了闡明傳統(tǒng)發(fā)酵乳品風(fēng)味品質(zhì)的形成機(jī)理，對(duì)其實(shí)現(xiàn)定向調(diào)控，勢(shì)必要解析多菌種相互作用與風(fēng)味代謝通路間的相關(guān)性。

當(dāng)前，多組學(xué)技術(shù)聯(lián)用可以涵蓋環(huán)境所有微生物的基因表達(dá)、蛋白或代謝物差異的多層面分析，快速獲取海量數(shù)據(jù)。利用多組學(xué)聯(lián)合揭示傳統(tǒng)發(fā)酵乳品特征風(fēng)味物質(zhì)的形成機(jī)理，并以此為導(dǎo)向篩選功能微生物，從而對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行指導(dǎo)[5]。我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的種類豐富，大量的菌種資源有待挖掘。本文總結(jié)了近年來(lái)多組學(xué)技術(shù)在解析傳統(tǒng)發(fā)酵乳品特征風(fēng)味成分的形成機(jī)理及其代謝調(diào)控的研究進(jìn)展，并對(duì)此領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行展望(表1)。

表1 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品類型及主要發(fā)酵劑Table 1 The type of traditional fermented dairy products and main starter

1 多組學(xué)技術(shù)在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來(lái)，微生態(tài)多樣性的鑒定由單菌落傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法及其核酸片段的PCR-DGGE電泳圖譜向高通量測(cè)序技術(shù)轉(zhuǎn)變[6]?；诟咄繙y(cè)序的宏基因組學(xué)以環(huán)境中所有微生物的基因組為研究對(duì)象，分析菌群多樣性并對(duì)不同代謝通路的功能基因聚類。LIU等首次利用功能基因組的多位點(diǎn)序列分型技術(shù)，成功將保加利亞乳桿菌發(fā)酵的酸化速率、產(chǎn)乙醛等表型特征與其功能基因序列結(jié)合，建立了一種可快速鑒定發(fā)酵菌是否具有良好發(fā)酵性能的方法[7]。利用色譜、質(zhì)譜串聯(lián)分析和光譜非靶向高精度定量的特點(diǎn)，使蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)作為表征菌落代謝產(chǎn)物的實(shí)時(shí)原位檢測(cè)和定量分析的有力方法，已用于檢測(cè)指導(dǎo)發(fā)酵乳制品中微生物和代謝物的實(shí)時(shí)變化[8-9]。

單個(gè)組學(xué)通常僅代表核酸、蛋白質(zhì)或代謝物一個(gè)層面的研究結(jié)果，對(duì)于物種之間的相互作用和表型預(yù)測(cè)缺少可靠的數(shù)據(jù)支撐。多組學(xué)聯(lián)合將各個(gè)水平的物質(zhì)分析“打通”，在探索生物于環(huán)境變化中細(xì)胞間的發(fā)育分化、信號(hào)傳導(dǎo)和互作網(wǎng)絡(luò)，為宿主響應(yīng)環(huán)境改變做出的應(yīng)激擾動(dòng)、宿主內(nèi)部代謝通路的調(diào)控提供有效調(diào)控靶點(diǎn)，是系統(tǒng)生物學(xué)研究發(fā)展的一大趨勢(shì)[10]。當(dāng)前，多組學(xué)技術(shù)聯(lián)用作為解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品“菌群-基因-代謝產(chǎn)物”關(guān)聯(lián)性的主要手段，從多水平剖析驗(yàn)證食品微生物的組成對(duì)發(fā)酵風(fēng)味品質(zhì)的形成機(jī)理[11]。

2 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品主要風(fēng)味成分

特征風(fēng)味作為發(fā)酵食品的“骨架”，是傳統(tǒng)發(fā)酵食品高附加值的體現(xiàn)。由于每種風(fēng)味成分具有不同的物性，僅憑單一的手段無(wú)法將所有風(fēng)味成分完整地提取出來(lái)[12]。隨著近幾年對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風(fēng)味導(dǎo)向調(diào)控成為研究熱點(diǎn)，利用代謝組學(xué)對(duì)痕量風(fēng)味物質(zhì)定性、定量，并結(jié)合電子鼻或嗅辨儀挖掘特征風(fēng)味成分(或關(guān)鍵活性風(fēng)味物質(zhì))，為進(jìn)一步闡明傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風(fēng)味形成機(jī)理和核心微生物的代謝機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[13]。本文參考徐巖等[14]對(duì)中國(guó)白酒、精油特征風(fēng)味成分的挖掘，繪制了特征風(fēng)味成分判定的技術(shù)路線(如圖1所示)[14-16]。

圖1 特征風(fēng)味化合物判定技術(shù)路線Fig.1 Technical roadmap of key aroma-active compound determination

乳制品發(fā)酵風(fēng)味取決于乳源中脂肪、蛋白和碳水化合物的相對(duì)平衡，其中乳酸、乙醛、雙乙酰、丁二酮和乙偶姻被證實(shí)對(duì)風(fēng)味有很大影響。此外，在開菲爾、酸馬奶、意大利干酪等有酵母參與的發(fā)酵乳制品中，醇類物質(zhì)是清香和酒香的重要貢獻(xiàn)者[17-18]。表2參考CHEN等總結(jié)列出了發(fā)酵乳制品中主要風(fēng)味成分及特征描述[19]。

表2 發(fā)酵乳品中主要風(fēng)味化合物、香氣描述及閾值Table 2 Main flavor compounds, aroma description and threshold in fermented dairy products

揮發(fā)性醛、酮等羰基類化合物的含量對(duì)發(fā)酵乳制品的香氣有顯著影響，乙醛和2,3-戊二酮的形成與蘇氨酸代謝通路有關(guān)[20-21]。揮發(fā)性醛類化合物是發(fā)酵乳中的微量香氣組分，微量的乙醛(23～40mg/kg)賦予酸乳青蘋果或堅(jiān)果味，過多的醛類會(huì)帶來(lái)青草臭[22]。酮類物質(zhì)多具有果香、花香和奶香味，其中雙乙酰是酸乳的特征風(fēng)味物質(zhì)，易被微生物的雙乙酰還原酶還原成乙偶姻。乙偶姻和雙乙酰具有相似的甜奶油香氣，但乙偶姻的風(fēng)味明顯弱于雙乙酰，且在適當(dāng)范圍(1.2～28.2mg/kg)可以減弱丁二酮的刺激性[23-24]。酯酶和醇?；D(zhuǎn)移酶的活性以及含醇量是發(fā)酵乳制品中酯類成分含量的限制因素，酯類的香氣閾值較低而對(duì)發(fā)酵乳的果味形成有很大貢獻(xiàn)[25]。不同濃度的酯類含量對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的貢獻(xiàn)不同，低濃度的酯類物質(zhì)對(duì)整體風(fēng)味的平衡有積極作用，還可以掩蓋或弱化過多的短鏈脂肪酸造成的異味或“不潔”味道[26]。

3 多組學(xué)聯(lián)用在微生物代謝與風(fēng)味形成機(jī)理研究的應(yīng)用

傳統(tǒng)發(fā)酵乳品是以乳酸菌、酵母和霉菌為主的多菌種共棲發(fā)酵，發(fā)酵風(fēng)味的形成與菌群相互作用、發(fā)酵環(huán)境改變引起的代謝通路相關(guān)酶的基因表達(dá)變化有關(guān)。通過多組學(xué)聯(lián)用對(duì)微生態(tài)多樣性、基因和代謝水平的差異分析，明確與特征風(fēng)味成分形成相關(guān)的微生物及其基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表征了發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)代謝調(diào)控關(guān)鍵的“生物標(biāo)志”?；趥鹘y(tǒng)發(fā)酵乳制品品種多樣，制作工藝和發(fā)酵菌種地域性差異較大，其中以干酪微生物研究最多。后文以傳統(tǒng)發(fā)酵干酪中的微生物代謝研究為例，介紹近年組學(xué)聯(lián)合在發(fā)酵微生物和風(fēng)味代謝有關(guān)基因的研究應(yīng)用。

3.1 發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種及代謝功能基因

同所有傳統(tǒng)發(fā)酵食品一樣，干酪中的微生物種類隨發(fā)酵成熟而變化。利用宏基因組聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)貉萏婧拖嚓P(guān)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，取代了傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法無(wú)法測(cè)量死細(xì)胞和不可培養(yǎng)菌的弊端，明確了樣本中活細(xì)胞和死細(xì)胞的DNA分子比例，便于了解不同發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)菌種[27]。

研究表明，意大利干酪由Lb.casei和Lb.buchneri等非“起子”乳桿菌驅(qū)動(dòng)成熟，其豐度隨成熟環(huán)境溫度的升高而增加[28]。Geotrichumcandidum和Penicilliumcamemberti等真菌是卡門培爾干酪成熟的主要貢獻(xiàn)菌，前者具有代謝氨苦味肽、增強(qiáng)干酪硫磺味的能力。功能基因注釋表征了干酪微生物含多種酪蛋白和氨基酸的分解酶系，其中P.freudenreichiisubsp.shermanii JS含有編碼絲氨酸蛋白酶HtrA和絲氨酸脫氨酶基因，以及寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和參與支鏈脂肪酸形成的支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因ilve[29]。同時(shí)，P.freudenreichii含有一些胞內(nèi)肽酶基因，如pepO，pepC，pepE，然而尚未闡明這些肽酶基因的存在對(duì)乳品苦味肽的降解有所貢獻(xiàn)[30]。

干酪內(nèi)部的碳水化合物代謝以乳糖分解和檸檬酸鹽代謝為主，最終形成乙醇、乳酸和一些C4揮發(fā)性風(fēng)味成分。然而很少有乳酸菌可直接利用檸檬酸鹽，利用宏基因組學(xué)可以判斷檸檬酸代謝基因的有無(wú)，或通過編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子草酰乙酸脫羧酶和檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)ζ浞诸怺31]。盡管在Lb.rhamnosus和Lb.helveticus均有編碼檸檬酸裂解酶的基因citD，citF和citE，但僅有Lb.rhamnosus擁有草酰乙酸脫羧酶基因，能夠?qū)幟仕猁}降解為丙酮酸。

3.2 風(fēng)味物質(zhì)形成途徑與菌種代謝功能基因表達(dá)

干酪中的微生物區(qū)系及其在發(fā)酵過程的活性決定了最終的發(fā)酵風(fēng)味，風(fēng)味物質(zhì)需要通過代謝有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與發(fā)酵微生物建立關(guān)系?；诤昊蚪M、轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合對(duì)菌群代謝基因表達(dá)和風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生時(shí)期進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以揭示發(fā)酵風(fēng)味的形成機(jī)理。

干酪中乳糖的分解代謝是形成C4揮發(fā)性成分的主要途徑。聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，發(fā)現(xiàn)乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用的相關(guān)基因片段在成熟早期由霉菌顯著表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)酵母含有乳糖代謝基因，證實(shí)G.candidum不具有乳糖分解能力。編碼乳糖特異性磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因lacEF和ptsl以及參與糖酵解和異生途徑的轉(zhuǎn)錄基因主要在Lc.lactis中高豐度表達(dá)[27]，此外，P.camemberti等真菌中的磷酸烯醇式丙酮酸激酶和果糖-1,6-二磷酸酶基因在干酪成熟早期高度表達(dá)，基于真菌代謝對(duì)干酪成熟的重要性，將磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因是否表達(dá)作為評(píng)判卡門培爾奶酪成熟過程正常與否的生物標(biāo)志物[32]。干酪內(nèi)部的碳水化合物代謝以乳糖分解和檸檬酸鹽代謝為主，最終形成乙醇、乳酸和一些C4揮發(fā)性風(fēng)味成分。檸檬酸鹽作為乳制品的特征風(fēng)味化合物雙乙酰和乙偶姻的前體物質(zhì)，也可以通過微生物降解。研究發(fā)現(xiàn)，瑞士干酪冷藏后熟期間，Lb.rhamnosus中乳糖和檸檬酸鹽分解相關(guān)的基因下調(diào)，使得后熟風(fēng)味物質(zhì)雙乙酰、乙醛降低。然而，Lc.lactis的代謝基因與之相反，其L-乳酸脫氫酶基因(ldh)在后熟期間顯著上調(diào)，促使同型乳酸發(fā)酵的進(jìn)行[30]。

酪蛋白和氨基酸是多種揮發(fā)性化合物的前體，前者通過幾種膜蛋白酶PrtP，PrtH和PrtR降解為肽，經(jīng)寡肽，二肽和三肽蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)家族轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞中被肽酶水解成氨基酸；后者通過轉(zhuǎn)氨基、脫氫、脫羧和C-S鍵斷裂等反應(yīng)酶系分解[30]。研究發(fā)現(xiàn)Lc.lactis具有兩條氨基酸分解途徑，其一由氨基轉(zhuǎn)移酶bcaT和araT催化支鏈氨基酸和芳香族氨基酸形成谷氨酸。當(dāng)支鏈氨基酸含量較低時(shí)，乳酸乳球菌IFPL730產(chǎn)生3-甲基丁醛及其還原物質(zhì)3-甲基丁醇等代謝通路上的有關(guān)基因araT,bcaT,kivD,ytjE和panE的表達(dá)增加，2種物質(zhì)均為切達(dá)奶酪的特征風(fēng)味成分。Lc.lactis中存在另一條由β-或γ-胱硫醚裂解酶催化甲硫氨酸脫氨、脫甲硫醇反應(yīng)[33]。含硫化合物的閾值低，微量即可具有強(qiáng)烈風(fēng)味。通過宏基因組功能聚類關(guān)聯(lián)風(fēng)味化合物豐度分析，表征了切達(dá)干酪成熟后期Brevibacteriumlinens、G.candidum和Staphylococcusxylosus的出現(xiàn)與甲硫醇及衍生物二甲硫醚的形成顯著相關(guān)[34]。

干酪熟化期間硬殼表面以碳水化合物代謝和細(xì)胞分裂代謝為主，而內(nèi)部以氨基酸和脂質(zhì)代謝為主。通常，脂肪分解與氨基酸代謝遵循相同的動(dòng)力學(xué)，即在干酪成熟第一周顯著表達(dá)，隨后趨于緩慢穩(wěn)定，產(chǎn)生的游離脂肪酸有利于干酪風(fēng)味品質(zhì)的形成。宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示G.candidum中脂肪代謝相關(guān)酶的基因高度表達(dá)，且表達(dá)水平隨干酪成熟而提高，是干酪脂肪分解的主要貢獻(xiàn)菌[27]。較高的熟化溫度促進(jìn)了干酪表面的乙偶姻和雙乙酰合成酶顯著表達(dá)，使得由丙酮酸合成脂肪酸代謝通路的基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)導(dǎo)致干酪內(nèi)部參與脂肪酸β-氧化的基因過表達(dá)，增加干酪內(nèi)部和表面的丁酸、戊酸等短鏈脂肪酸形成[28]。然而，高水平的脂肪酸帶來(lái)脂肪酸敗和乳臭味等不良感官影響，研究表明L.lactis中游離脂肪酸合成的代謝通路受長(zhǎng)鏈?；d體蛋白抑制物調(diào)控，避免游離脂肪酸的積累導(dǎo)致整體風(fēng)味的失衡[35]。

4 展望

多組學(xué)技術(shù)聯(lián)用被視為微生物研究的未來(lái)，在分析菌群演替、確定功能基因、發(fā)掘活性成分的代謝網(wǎng)絡(luò)等具有“1+1>2”的顯著優(yōu)勢(shì)。但是，國(guó)內(nèi)外利用多組學(xué)技術(shù)在解析傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品微生物演替或代謝機(jī)理的研究尚處于起步階段。一方面，傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的制作工藝存在差異性，發(fā)酵環(huán)境具有空間異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)可變性，發(fā)酵菌群不均勻分布，導(dǎo)致不同生長(zhǎng)點(diǎn)的微生物通過不同機(jī)制的相互作用各自演化，出現(xiàn)多種表型，使得多組學(xué)聯(lián)用的結(jié)論缺少代表性。其次，測(cè)序平臺(tái)和質(zhì)譜儀器的研發(fā)速度超過了分析軟件或數(shù)據(jù)庫(kù)的開發(fā)，導(dǎo)致迄今仍有海量的數(shù)據(jù)無(wú)法得到充分解析。

隨著組學(xué)檢測(cè)成本的降低，通過多組學(xué)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化、差異基因表達(dá)和代謝物的組成來(lái)構(gòu)建發(fā)酵菌群預(yù)測(cè)模型，勢(shì)必成為傳統(tǒng)發(fā)酵食品主要的研究方向。將環(huán)境因子納入多組學(xué)的大數(shù)據(jù)分析，來(lái)預(yù)測(cè)特定環(huán)境中微生物群落的生理特性和結(jié)構(gòu)演替，使多組學(xué)數(shù)據(jù)能更客觀地揭示發(fā)酵菌群的互作機(jī)制。對(duì)于獲取的多組學(xué)海量數(shù)據(jù)，配套的數(shù)據(jù)庫(kù)和多元統(tǒng)計(jì)分析模型的建立也需及時(shí)跟進(jìn)。最后，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)是驗(yàn)證多組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)微生態(tài)結(jié)構(gòu)最直觀的方法，對(duì)于新基因的注釋、功能表征和物種的生理鑒定都是必要的，目前多組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的結(jié)果仍是系統(tǒng)生物學(xué)中缺失的一環(huán)[36]。綜上，多組學(xué)聯(lián)用正在各種傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究中逐步普及，然而面對(duì)大數(shù)據(jù)如何分析挖掘、如何使結(jié)果能客觀還原傳統(tǒng)發(fā)酵體系，以表征傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質(zhì)成熟機(jī)理是首要問題。