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        啟動子串聯(lián)及改造提高FAD為輔基的葡萄糖脫氫酶在Bacillus subtilis中的表達

        2019-05-07 08:00:24張玲林榮宋祖坤王男楊海麟
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年8期
        關(guān)鍵詞:菌體質(zhì)粒葡萄糖

        張玲,林榮,宋祖坤,王男,楊海麟*

        1(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫, 214122) 2(蘇州盛迪亞生物醫(yī)藥有限公司,江蘇 蘇州, 215000)

        葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)被廣泛應(yīng)用于血糖指標的臨床生化檢測。近些年發(fā)現(xiàn)葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH)具有替代葡萄糖氧化酶的應(yīng)用潛力,因其不以氧氣為電子受體,不受溶解氧的限制,檢測結(jié)果誤差更小[1-2]。葡萄糖脫氫酶按照輔基或輔酶差異可分為[3]:(1)以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(hicotinamide adenine dinucleotide, NAD(P)+)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(NAD(P)-GDH,EC 1.1.1.47)。(2)以吡咯并喹啉醌(pyvrolidine quinoline quinone, PQQ)為輔基的葡萄糖脫氫酶(PQQ-GDH,EC 1.1.5.2)。(3)以黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)為輔基的葡萄糖脫氫酶(FAD-GDH,EC 1.1.99.10)。其中FAD-GDH以輔基結(jié)合緊密,催化效率較高,可作為替代目前診斷用葡萄糖氧化酶的首選。

        具有活性的FAD-GDH可能為單體[4]或同源二聚體[5]。FAD-GDH主要來源于絲狀真菌[6],如:Penicilliumsp.[7],Mucorsp.[8],Aspergillussp.[9-10],Glomerellacingulata[11]等,重組表達和純化較為困難。來源于Glomerellacingulata的FAD-GDH在E.coli中重組表達,常常需要與分子伴侶系統(tǒng)共表達才能實現(xiàn)可溶性表達,蛋白純化和放大生產(chǎn)較為困難[11]。在酵母菌中表達量較高,但存在糖基化修飾,會干擾血糖檢測電極的靈敏度,實際生產(chǎn)應(yīng)用中需進行酶的去糖基化步驟[12]。

        FAD-GDH罕見于細菌。本團隊先前嘗試將來源于細菌Burkholderiacepacia的FAD-GDH基因(gdh)在大腸桿菌中表達,該酶熱穩(wěn)定性好,Tm值可達77 ℃。為了探索該基因在其他宿主的表達情況,本文嘗試將來源于原核Burkholderiacepacia的gdh基因在枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中表達??莶菅挎邨U菌作為表達宿主,遺傳背景清楚,對培養(yǎng)基要求較低,生長快速,不產(chǎn)內(nèi)毒素,適用于原核生物來源重組蛋白的分泌表達。

        篩選高效的啟動子可實現(xiàn)外源基因在枯草芽孢桿菌中高效表達。啟動子依據(jù)是否需要誘導(dǎo)分為:(1)組成型啟動子,如P43,PHpaⅡ,PamyQ’;(2)誘導(dǎo)型啟動子,如Popuaa,Pgsib。組成型的啟動子能在菌體內(nèi)持續(xù)進行基因表達,受環(huán)境因素的影響較少,或變化很小。誘導(dǎo)型啟動子在誘導(dǎo)因子存在下,相應(yīng)的基因被激活,基因表達,積累目的產(chǎn)物[13]。許多研究表明雙啟動子相比單啟動子更能促進外源基因的表達。重組菌株B.subtilisCCTCCM 2016536用于表達β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶,雙啟動子PHpaⅡ-PamyQ’表達系統(tǒng)的表達量是單個啟動子PamyQ’表達系統(tǒng)表達量的1.3倍,主要由于雙啟動子下外源基因轉(zhuǎn)錄水平高于單啟動子[14]。啟動子PAmyR2和啟動子Pblma分別插入PHpaII啟動子的下游,4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的表達量和單啟動子PHpaII比較分別提高11、12倍[15]。雙啟動子PHpaII-PgsiB表達氨肽酶分別是單個PHpaII和PgsiB啟動子表達的2.3和2.2倍[16]。

        將啟動子突變改造也是提高枯草芽孢桿菌產(chǎn)物積累的有效辦法。碳源代謝在菌體發(fā)酵過程中占有重要地位,表達外源產(chǎn)物的過程中碳代謝產(chǎn)物例如葡萄糖等,會對目的產(chǎn)物的生成產(chǎn)生抑制作用,即碳代謝產(chǎn)物抑制(carbon catabolite repression,CCR),這種抑制作用主要是通過碳代謝控制蛋白A (carbon catabolite protein A,CcpA) 復(fù)合物結(jié)合到啟動子區(qū)域的cre位點抑制轉(zhuǎn)錄[17]。cre位點的突變可有效地減少CcpA介導(dǎo)的碳代謝抑制作用。NICHOLSON等通過隨機突變篩選得到抗碳代謝產(chǎn)物的淀粉酶生產(chǎn)菌株,經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)amyE啟動子的cre序列中GC堿基突變成AT[18]。NAGARAJAN等克隆來自高產(chǎn)淀粉酶的BacillussubtilisKCC103菌株的啟動子amyR4,該啟動子能夠有效地抵抗碳代謝產(chǎn)物的抑制,實現(xiàn)異源蛋白的高效表達,序列研究表明啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游cre序列中+4(C-T),-7(T-A)堿基發(fā)生突變[19]。

        本研究嘗試將Burkholderiacepacia的FAD-GDH基因(gdh)在蛋白酶缺陷型菌株B.subtilisWB600中進行表達,通過啟動子篩選、串聯(lián)及改造等策略,以期獲得FAD-GDH高表達量。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 菌株

        葡萄糖脫氫酶基因(gdh)由南京金斯瑞合成,構(gòu)建于載體pUC57;E.coliJM109,B.subtilis168,B.subtilisWB600菌株由實驗室保存(表1)。

        1.1.2 主要試劑

        限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶、蛋白質(zhì)Low Marker、DNA Marker均購自大連寶生物有限公司;PCR產(chǎn)物回收試劑盒;DNA凝膠回收試劑盒購自上海生工股份有限公司;其他所用試劑均購于國藥集團藥業(yè)股份有限公司。

        1.1.3 培養(yǎng)基及緩沖液

        (1) LB培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5.0,蛋白胨10.0,NaCl 5.0,加入2%(質(zhì)量分數(shù))的瓊脂即為LB固體培養(yǎng)基。(2) TB培養(yǎng)基(g/L):甘油4.0,酵母粉24.0,蛋白胨12.0,溶解在800 mL去離子水中,高壓滅菌后冷卻至40 ℃加入200 mL滅菌的緩沖液(K2HPO416.4 g,KH2PO42.32 g,溶解于去離子水中,定容至200 mL,0.22 μm的濾膜過濾除菌或高壓滅菌)。(3) 抗 生素溶液:先配置成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的母液,然后用0.22 μm的濾膜過濾除菌,用小的EP管分裝,置于-20 ℃ 保存。(4) 磷酸鉀緩沖液(phospate buffered,PB,50 mmol/L, pH 7.0):取86 mL的0.1 mol/L K2HPO4,加入14 mL的0.1 mol/L KH2PO4,再加入100 mL水,調(diào)節(jié)pH至7.0。

        1.2 方法

        1.2.1 重組質(zhì)粒pMA5-1的構(gòu)建

        以質(zhì)粒pUC57-gdh為模板進行PCR擴增,引入BamHⅠ/MluⅠ位點,擴增產(chǎn)物回收雙酶切,與同樣雙酶切的質(zhì)粒pMA5連接,構(gòu)建表達質(zhì)粒pMA5-1。

        1.2.2 串聯(lián)啟動子重組質(zhì)粒的構(gòu)建

        以B.subtilis168的DNA為模板,利用引物PamyQ’-F/PamyQ’-R,P43-F/P43-R,PgsiB-F/PgsiB-R, Popuaa-F/ Popuaa-R,分別PCR擴增相應(yīng)的啟動子序列,同時引入NdeⅠ/MluⅠ位點,雙酶切啟動子序列與同樣雙酶切的質(zhì)粒pMA5-1連接,構(gòu)建雙啟動子質(zhì)粒pMA5-1n(表2)。

        1.2.3 培養(yǎng)方法

        種子液的制備:從卡納抗性的固體培養(yǎng)基上,挑取重組菌B.subtilis單菌落,接種到LB液體培養(yǎng)基,37 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng)8 h。

        表2 實驗所用引物Table 2 Oligonucleotides used in this study

        搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):以體積分數(shù)4%轉(zhuǎn)接種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃,220 r/min,培養(yǎng)48 h。

        1.2.4 菌體生物量測定

        取20 mL不同濃度的菌液,8 000 r/min離心10 min, 用pH 7.0,50 mmol/L的PB緩沖液清洗2次,測定濕重,105 ℃烘干至恒定值,稱取干重。菌體濕重約是干重的3.8倍。

        1.2.5 葡萄糖脫氫酶酶活測定及SDS-PAGE分析

        酶活定義:在一定條件下,每分鐘還原1 μmol DCPIP所需的酶量定義為一個酶活單位。

        取100 μL適當稀釋的酶液,加入3 mL顯色液(50 mmol/L pH 7.0的PB緩沖液, 0.03 mmol/L的DCPIP,1.6 mmol/L的PMS,100 mmol/L的葡萄糖溶液)輕輕混勻,用重蒸水調(diào)零,37 ℃每隔1 min記錄600 nm處吸光值的變化,共記錄2~3 min。

        用酶的緩沖液代替酶液作為對照。

        采用5%的濃縮膠與15%的分離膠,pH 8.3的Tris-Gly電泳緩沖液,90 V恒壓,將剝離電泳后的膠,染色,脫色。膠的具體配置操作方法參照SDS-PAGE試劑盒。

        1.2.6 基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析

        樣品處理:(1)用刀片切下膠上目標條帶,放入離心管中;(2)加入400 μL脫色液脫色,清洗至透明,去除上清,凍干或加50 μL乙腈,放置5 min,去除乙腈,重復(fù)1次,晾干,膠粒應(yīng)為白色;(3)加入90 μL 100 mmol/L NH4HCO3,10 μL 100 mmol/L DTT,56 ℃ 放置30 min; (4)去上清,加100 μL 100%乙腈,5 min后吸去;(5)加入70 μL 100 mmol/L NH4HCO3,30 μL 200 mmol/L IAA,暗處理20 min;(6)去上清,加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3,室溫放置15 min;(7)去上清,加入100 μL 100%乙腈,5 min后吸去,凍干或加50 μL乙腈,放置5 min,去除乙腈,重復(fù)1次,晾干,膠粒應(yīng)為白色;(8)加入6 μL酶液,4 ℃放置30~60 min,使膠塊充分吸漲;(9)加入20 μL 25 mmol/L NH4HCO3緩沖液,37 ℃放置20 h左右;(10)取0.6 μL酶解液點樣,自然晾干,覆蓋0.6 μL基質(zhì),晾干。進行上機質(zhì)譜分析,并將得到的結(jié)果導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站比對。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 重組質(zhì)粒pMA5-1的構(gòu)建表達及蛋白質(zhì)譜鑒定

        將gdh基因構(gòu)建到pMA5上轉(zhuǎn)入B.subtilis,研究是否能夠表達具有活性的FAD-GDH。將pMA5-1轉(zhuǎn)化E.coliJM109,經(jīng)過氨芐抗性平板篩選,從陽性轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒,利用BamHⅠ和MluⅠ雙酶切電泳驗證,驗證結(jié)果如圖1,凝膠電泳條帶與目的基因大小一致,并將驗證正確的基因測序,與目的序列比對,結(jié)果表明構(gòu)建成功。

        M-DNA marker;1-pMA5-1雙酶切產(chǎn)物圖1 pMA5-1雙酶切驗證Fig.1 Identification of pMA5-1 by restriction digestion

        將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pMA5-1轉(zhuǎn)入B.subtilis感受態(tài)WB600,從含有卡納抗性的平板上挑選陽性克隆,獲得重組菌株WB1,將獲得的重組菌搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h,菌體離心收集,細胞破碎,上清離心,測得酶活為962 U/L,并將離心獲得的上清取30 μL,加入10 μL 4×SDS-PAGE的上樣緩沖液,煮沸10 min,進行SDS-PAGE檢測,結(jié)果見圖2,由于空白對照處也存在一條60 kDa的條帶,所以將WB1破壁上清SDS-PAGE圖譜中60 kDa處的條帶切膠回收,進行飛行質(zhì)譜分析,比對結(jié)果顯示與目的條帶匹配度最高的為來源于Burkholderiacepacia的葡萄糖脫氫酶,分子質(zhì)量60 kDa,進一步表明FAD-GDH在B.subtilisWB600中表達成功。

        M-蛋白質(zhì)marker;1-對照;WB0-破壁上清;2-WB1破壁上清圖2 B. subtilis表達FAD-GDH SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE identification of B. subtilis expression FAD-GDH

        2.2 串聯(lián)啟動子提高FAD-GDH的表達

        采用雙啟動子串聯(lián)策略來提高FAD-GDH的表達量,本文選取的啟動子見表3。啟動子PHpaⅡ是質(zhì)粒pMA5上自帶的啟動子,本文選取其他4種啟動子串聯(lián)在PHpaⅡ下游構(gòu)建含有雙啟動子。其中PamyQ’和P43為組成型的啟動子,具有強啟動性、無需添加誘導(dǎo)劑可直接產(chǎn)生目的蛋白的優(yōu)勢;PgsiB和Popuaa為鹽誘導(dǎo)型啟動子,受鹽濃度激活調(diào)控目的蛋白大量產(chǎn)生的特點。4種雙啟動子表達質(zhì)粒pMA5-11(PHpaII-PamyQ’),pMA5-12(PHpaII-P43),pMA5-13(PHpaII-PgsiB),pMA5-14(PHpaII-Popuaa)構(gòu)建流程見圖3。

        以B.subtilis168基因組為模板進行PCR擴增相應(yīng)的啟動子序列,擴增產(chǎn)物回收雙酶切插入啟動子PHpaII的下游,分別獲得重組質(zhì)粒pMA5-11,pMA5-12,pMA5-13,pMA5-14。利用NdeⅠ和MluⅠ雙酶切電泳驗證,驗證結(jié)果如圖4,并將驗證正確的基因測序,與目的序列比對,比對結(jié)果表明構(gòu)建成功。

        分別將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pMA5-11,pMA5-12,pMA5-13,pMA5-14,轉(zhuǎn)化感受態(tài)B.subtilisWB600,從含有卡納抗性的平板上挑選陽性克隆,獲得菌株WB11,WB12,WB13,WB14,以及含有單啟動子PHpaⅡ的重組菌WB1,將獲得的上述重組菌與含有單啟動子PHpaⅡ的重組菌WB1分別搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h,菌體離心收集,細胞破碎。

        表3 本文所構(gòu)建的來源于B. subtilis的啟動子Table 3 The promoter from B. subtilis used in this study

        圖3 串聯(lián)啟動子載體pMA5-1n的構(gòu)建流程Fig.3 Construction procedure of double promoter vector pMA5-1n

        不同啟動子的強度通過測定菌體胞內(nèi)酶活來衡量。PamyQ’和P43為組成型的啟動子[21-23],PgsiB和Popuaa為鹽誘導(dǎo)型啟動子[24-26],受鹽濃度激活,可利用質(zhì)量濃度為4 g/L的NaCl進行誘導(dǎo)表達。含單啟動子PHpaⅡ重組菌株WB1及4種雙啟動子重組菌WB11,WB12,WB13,WB14的胞內(nèi)酶活分別為924、2 497、 578、740、878 U/L(圖5-a)。其中含有組成型啟動子PamyQ’的雙啟動子重組菌WB11 (PHpaⅡ-PamyQ’)胞內(nèi)酶活最高,約是酶活最低的重組菌株WB12的4倍,是單啟動子PHpaⅡ表達FAD-GDH酶活的2.7倍。分別取30 μL上述離心獲得的上清加入10 μL 4×的上樣緩沖液,煮沸10 min,進行SDS-PAGE檢測,結(jié)果見圖5-b, 重組菌發(fā)酵液在60 kDa處都有目的蛋白產(chǎn)生。

        M-DNA marker;1-pMA5-11雙酶切產(chǎn)物;2- pMA5-12雙酶切產(chǎn)物;3-pMA5-13雙酶切產(chǎn)物;4-pMA5-14雙酶切產(chǎn)物圖4 雙啟動子載體pMA5-1n雙酶切驗證Fig.4 Identification of double promoter vector pMA5-1n by restriction digestion

        a-含雙啟動子重組B.subtilis產(chǎn)FAD-GDH的酯活水平和菌體量;b-含雙啟動子重組B.subtilis表達FAD-GDH的SDS-PAGE鑒定M-蛋白質(zhì)marker;1-WB1破壁上清;2-WB11破壁上清;3-WB12破壁上清;4-WB13破壁上清;5-WB14破壁上清圖5 雙啟動子表達FAD-GDH結(jié)果及SDS-PAGE鑒定Fig.5 Result of double promoter expression FAD-GDH and SDS-PAGE identification

        2.3 刪除啟動子PamyQ’上cre位點促進FAD-GDH的發(fā)酵產(chǎn)酶

        上述研究中表明最佳的串聯(lián)雙啟動子PHpaII-PamyQ’使酶活提高到2 497 U/L,具有促進該酶表達的效果,但有研究表明PamyQ’啟動子在發(fā)酵過程中會受到葡萄糖濃度的抑制,隨著葡萄糖濃度的增加會明顯抑制產(chǎn)酶[14]。本研究先考察葡萄糖是否會嚴重抑制串聯(lián)啟動子PamyQ’突變菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶。比較不同濃度的葡萄糖和甘油條件下該突菌變株的發(fā)酵產(chǎn)酶情況。

        將改造前重組菌WB11(含有雙啟動子PHpaII-PamyQ’)發(fā)酵培養(yǎng)48 h,收集菌體,酶活驗證是否存在碳代謝產(chǎn)物抑制效應(yīng)。結(jié)果如圖6,通過測定酶活檢測FAD-GDH的表達情況,隨著培養(yǎng)基碳源的葡萄糖或甘油濃度的增加,菌體量上升,酶活逐漸下降。未添加葡萄糖,菌體胞內(nèi)酶活是添加30 g/L的葡萄糖培養(yǎng)菌體胞內(nèi)酶活的1.5倍;當未添加甘油,胞內(nèi)酶活是添加3%(體積分數(shù))的甘油胞內(nèi)酶活的2倍,說明串聯(lián)啟動子PamyQ’后碳源濃度增加會抑制產(chǎn)酶。

        a-不同質(zhì)量濃度葡萄糖對改造前后重組菌產(chǎn)酶的影響;b-不同體積分數(shù)甘油對改造前后重組菌產(chǎn)酶的影響圖6 改造前后重組菌產(chǎn)FAD-GDH水平及菌體生長情況Fig.6 FAD-GDH expression and cell growth of reconstituted bacteria before and after transformation

        枯草芽孢桿菌中,碳代謝產(chǎn)物的抑制效應(yīng)主要是通過碳代謝控制蛋白CcpA,結(jié)合到啟動子區(qū)域的cre位點抑制轉(zhuǎn)錄。cre位點是一段含有回文結(jié)構(gòu),存在一些堿基保守的序列。CcpA如何與多樣的cre位點結(jié)合,具體的機制還不清楚,但改造和移除該位點可有效減少碳代謝的抑制[18-19]。

        為了減少碳代謝產(chǎn)物的抑制效應(yīng),基于雙啟動子PHpaII-PamyQ’,通過重疊延伸PCR[27]移除PamyQ’啟動子中14個核苷酸的cre位點,構(gòu)建雙啟動子PHpaII-PamyQ2,轉(zhuǎn)入B.subtilisWB600,構(gòu)建WB2重組菌,發(fā)酵培養(yǎng)基添加30 g/L的葡萄糖,菌體胞內(nèi)酶活力達3 626 U/L, 約是啟動子改造前添加30 g/L的葡萄糖菌體胞內(nèi)酶活的2.2倍。如圖7-b重組菌株WB2發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2%(體積分數(shù))的甘油菌體胞內(nèi)酶活力達3 119 U/L,是改造之前重組菌株WB11添加2%的甘油菌體胞內(nèi)酶活的2.1倍。重組菌株WB111發(fā)酵培養(yǎng)中添加3%的甘油胞內(nèi)酶活比添加2%的甘油有所下降,可能是過多的碳源導(dǎo)致菌體生長過快,抑制重組蛋白表達。

        為了驗證改造后的重組菌WB2,培養(yǎng)時添加高濃度的葡萄糖是否會抑制FAD-GDH的表達,向培養(yǎng)基中分別添加40、50、60、70 g/L的葡萄糖,測定破碎菌體上清中的酶活及菌體干重,結(jié)果如圖7,隨著葡萄糖濃度的上升,菌體干重趨于穩(wěn)定,可能是菌體生長受到溶解氧濃度的限制,胞內(nèi)酶活隨著葡萄糖濃度上升而下降,過快的生長速度導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。培養(yǎng)基添加30~40 g/L的葡萄糖,一定程度上促進菌體生長及酶的表達,刪去啟動子PamyQ’的cre位點可減少碳源代謝產(chǎn)物對基因轉(zhuǎn)錄的抑制,促進外源基因表達。

        圖7 高濃度葡萄糖對改造后重組菌WB2生長及FAD-GDH表達的影響Fig.7 FAD-GDH expression and cell growth of recombinant WB2 with more glucose

        3 結(jié)論

        構(gòu)建含有單啟動子PHpaⅡ的重組質(zhì)粒pMA5-1,轉(zhuǎn)入B.subtilis,測定酶活及飛行時間質(zhì)譜鑒定表明重組菌表達了具有活性的FAD-GDH。分別選取2種組成型啟動子(PHpaⅡ-PamyQ’,PHpaⅡ-P43)和兩種鹽誘導(dǎo)型啟動子(PHpaⅡ-PgsiB,PHpaⅡ-Popuaa)串聯(lián)成雙啟動子分別表達FAD-GDH,含組成型雙啟動子PHpaⅡ-PamyQ’的重組B.subtilis,胞內(nèi)表達量最高為2 497 U/L,PHpaⅡ-PamyQ’雙啟動子表達強度增加可能是由于轉(zhuǎn)錄強度增加。本實驗中采用的其他雙啟動子表達FAD-GDH的活性低于單啟動子,可能是啟動子之間的排列順序會影響啟動之間的相互作用,靠近異源基因的啟動子可能會更大程度地影響外源基因的表達[28]。在PHapII與gdh基因之間插入不同的啟動子后,其RBS也被隨之替換為新插入啟動子的RBS,因此酶活性的變化也很有可能是由于翻譯強度的變化引起的。

        發(fā)酵過程中,發(fā)現(xiàn)葡萄糖和甘油會抑制串聯(lián)啟動子PamyQ’突變株的發(fā)酵產(chǎn)酶,存在碳代謝產(chǎn)物抑制效應(yīng)。為了減少發(fā)酵中的碳代謝抑制,采取刪去PamyQ’啟動子中與碳代謝阻遏因子結(jié)合的cre位點,構(gòu)建的含有缺失cre位點的雙啟動子PHpaⅡ-PamyQ2重組B.subtilis,使FAD-GDH酶活從2 497 U/L提高到3 626 U/L, 說明啟動子PamyQ’中cre位點的刪除有效地減少了碳源代謝產(chǎn)物對基因轉(zhuǎn)錄的抑制,促進外源基因表達。

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