劉旭峰，王寧，郝亞男，李英滋，范曉光,2，謝希賢,2*

1(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室(天津科技大學)，天津，300457) 2(天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津，300457)

蘇氨酸化學名為α-氨基-β-羥基丁酸，是人體必需的8種氨基酸之一[1]。主要應用于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品強化劑、飼料添加劑等方面。蘇氨酸是繼谷氨酸和賴氨酸，世界第三大氨基酸產(chǎn)品[2]。大腸桿菌由于繁殖迅速、發(fā)酵溫度高、生理生化基礎研究比較深入等特征，成為蘇氨酸生產(chǎn)最主要的菌株。蘇氨酸工程菌的構(gòu)建經(jīng)歷了2個重要的階段。(1)誘變育種階段，日本味之素株式會社椎尾勇等，經(jīng)誘變育種篩選出有產(chǎn)蘇氨酸能力的菌株；(2)基因工程階段，研究人員運用代謝工程技術(shù)與系統(tǒng)生物學方法構(gòu)建蘇氨酸工程菌，如韓國LEE等[3]。

蘇氨酸作為大宗氨基酸產(chǎn)品，提高發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率可顯著降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。常規(guī)基因工程技術(shù)和代謝工程技術(shù)一般采用加強主要代謝途徑，阻斷競爭代謝途徑以減少代謝分流來提高產(chǎn)品合成效率，但是一些競爭途徑的代謝基因敲除經(jīng)常會對細胞生長造成負面影響[4-5]。代謝干擾可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平，進而優(yōu)化代謝網(wǎng)絡，提高合成效率[6]。目前，代謝干擾主要方法有反義RNA技術(shù)和CRISPRi技術(shù)[7-8]。反義RNA技術(shù)因具有操作簡單，適用范圍廣泛，特異性強以及安全性高的特點被應用于代謝干擾研究。反義RNA技術(shù)中sRNAs(small regulatory RNAs)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄技術(shù)應用較為廣泛。sRNAs由2個部分組成：支架序列和目標綁定序列，在大腸桿菌中自然形成二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)能夠識別目標mRNA并為Hfq蛋白提供1個支架，使目標mRNA降解或三者結(jié)合形成的復合物阻礙核糖體與目標mRNA的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。NA等[9]以1，5-戊二胺工程菌E.coliXQ56為出發(fā)菌，利用sRNAs技術(shù)調(diào)控基因murE表達，在高密度培養(yǎng)的條件下，對應菌株產(chǎn)酸較原菌XQ56高31%。CRISPRi技術(shù)是基于RNA引導的DNA核酸內(nèi)切酶的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展而來，與CRISPR/Cas9系統(tǒng)不同之處在于前者的Cas9蛋白失去了DNA核酸內(nèi)切酶的活力[10]。CRISPRi干擾體系由dCas9蛋白和sgRNA兩個組件構(gòu)成，其中與dCas9蛋白共同表達的sgRNA由3部分組成：20 nt目標基因特定核苷酸區(qū)域的識別序列、42 nt dCas9蛋白結(jié)合序列以及40 nt轉(zhuǎn)錄終止子序列[11-13]。CRISPRi工作機制為當成熟的sgRNA引導dCas9蛋白結(jié)合在DNA的特定位置時，三者形成的復合物能夠影響轉(zhuǎn)錄延伸、RNA聚合酶以及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而實現(xiàn)調(diào)節(jié)基因表達水平的目的。CRISPRi技術(shù)具有靈活高效的特點，可以調(diào)控任意基因轉(zhuǎn)錄水平，該技術(shù)現(xiàn)在也已經(jīng)被廣泛應用于代謝工程領域和合成生物領域[14-21]。

本研究以蘇氨酸工程菌E.coliTHRD為出發(fā)菌，依據(jù)CRISPRi干擾機制[18, 20]，建立了基于阿拉伯糖誘導的CRISPRi代謝干擾系統(tǒng)，該系統(tǒng)首先將dcas9基因整合在基因組上并受控于阿拉伯糖啟動子，同時，用pGRB質(zhì)粒表達特異的sgRNA。利用上述干擾體系研究中心代謝途徑主要基因的轉(zhuǎn)錄水平的改變對蘇氨酸合成的影響。發(fā)酵結(jié)果表明，調(diào)節(jié)zwf、pfkA以及gltA基因的表達水平可以提高工程菌的蘇氨酸合成效率。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

蘇氨酸工程菌E.coliTHRD保藏在天津科技大學菌種保藏中心，實驗所涉及的菌種及質(zhì)粒見表1。

表1 本實驗所用菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this study

1.2 培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基

大腸桿菌THRD工程菌及完成基因編輯的菌株培養(yǎng)條件為LB培養(yǎng)基、37 ℃培養(yǎng)，含有pRedCas9質(zhì)粒的菌株培養(yǎng)條件為LB培養(yǎng)基、32 ℃培養(yǎng)；大腸桿菌DH5α用于構(gòu)建和克隆質(zhì)粒，培養(yǎng)條件為LB培養(yǎng)基、37 ℃培養(yǎng)。氨芐青霉素工作質(zhì)量濃度為100 μg/L；奇霉素工作質(zhì)量濃度為100 μg/L。

LB培養(yǎng)基，2-YT培養(yǎng)基和SOC培養(yǎng)基參見分子克隆實驗指南。

蘇氨酸種子培養(yǎng)基配方：25 g/L蔗糖、10 g/L酵母粉、6 g/L蛋白胨、1.2 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4、 10 mg/L MnSO4、10 mg/L FeSO4、1.3 mg/L VB1、0.3 mg/L VH。

蘇氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基：30 g/L葡萄糖、2 g/L酵母粉、4 g/L蛋白胨、1 g/L檸檬酸鈉、2 g/L KH2PO4、0.7 g/L MgSO4、0.1 g/L MnSO4、0.1 g/L FeSO4、0.8 mg/L VB1、0.2 mg/L VH。

1.3 CRISPR/Cas9基因編輯方法

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對菌株進行基因編輯[22-24]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括pGRB和pRedCas9兩個質(zhì)粒，其中pRedCas9質(zhì)粒包含pGRB的消除系統(tǒng)、重組酶、Cas9蛋白表達系統(tǒng)和奇霉素抗性；pGRB質(zhì)粒包括gRNA序列、Cas9蛋白結(jié)合區(qū)域序列、終止子序列和氨芐青霉素抗性。構(gòu)建質(zhì)粒pGRB的目的是為了轉(zhuǎn)錄相應sgRNA，與Cas9蛋白形成復合體并識別靶位點，使Cas9蛋白準確切割雙鏈目的基因。同時，在重組酶的作用下，通過同源重組將目的DNA片段整合在基因組上，完成基因編輯。

1.3.1 構(gòu)建gRNA質(zhì)粒和DNA片段的獲得

為了構(gòu)建gRNA質(zhì)粒，先設計合成2條反向互補的單鏈DNA，通過退火形成雙鏈DNA，該雙鏈DNA中間序列為靶位點的特定gRNA間隔序列，兩端序列與pGRB具有同源序列。雙鏈DNA與線性化pGRB通過同源重組形成gRNA表達質(zhì)粒。

利用引物設計軟件primer 5，以待編輯基因的上下游序列為模板，設計上下游同源臂引物；以待整合基因為模板，設計整合基因的擴增引物。通過PCR的方法分別擴增上下游同源臂和目的基因片段，再經(jīng)過重疊PCR制備重組片段。

1.3.2 菌株構(gòu)建

首先，將pRedCas9質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)導入E.coliTHRD感受態(tài)細胞中。通過菌落PCR篩選正確的陽性轉(zhuǎn)化子，并將該菌株接種于LB培養(yǎng)基32 ℃過夜培養(yǎng)，然后按1%的接種量轉(zhuǎn)移到100 mL 2-YT培養(yǎng)基中，32 ℃ 培養(yǎng)細胞OD600達到0.1～0.2，添加0.1 mmol/L IPTG誘導重組酶表達，繼續(xù)培養(yǎng)細胞OD600達到0.4～ 0.5，收集菌體制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞。將200 ng重疊DNA片段和100 ng gRNA質(zhì)?；靹蛟陔娹D(zhuǎn)感受態(tài)細胞中，并轉(zhuǎn)移至0.1 cm電轉(zhuǎn)杯中，用Eppendorf電轉(zhuǎn)儀在1 850 kV條件下將質(zhì)粒和DNA片段導入細胞，同時加入1 mL SOC中32 ℃復蘇2 h，然后取100 μL 涂布到含氨芐和奇霉素抗性的LB平板上，32 ℃ 過夜培養(yǎng)。隨機挑取單菌落進行菌落PCR驗證，根據(jù)菌落PCR的DNA片段大小確定陽性重組菌株。將陽性菌株在含有0.3 g/L阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導pRedCas9中pGRB消除系統(tǒng)將pGRB消除；由于pRedCas9是溫敏型質(zhì)粒，通過將菌株在42 ℃下培養(yǎng)消除pRedCas9質(zhì)粒，獲得無質(zhì)粒工程菌株。

1.4 干擾質(zhì)粒及菌株構(gòu)建

干擾質(zhì)粒與gRNA質(zhì)粒構(gòu)建方法相同，方法同上。將構(gòu)建成功的干擾質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至以THRD-1為基礎的蘇氨酸大腸桿菌工程菌中，取100 μL稀釋涂布到含氨芐抗性的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，篩選陽性菌株。

1.5 蘇氨酸發(fā)酵

將菌株經(jīng)斜面活化后接種于裝液量為30 mL的種子培養(yǎng)基中(500 mL搖瓶)，37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)10 h。然后以10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在發(fā)酵培養(yǎng)4 h添加誘導劑阿拉伯糖，終質(zhì)量濃度控制在0.6 g/L。在37 ℃，200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.6 發(fā)酵過程中檢測與分析

大腸桿菌生物量的測定利用分光光度計在600 nm處的吸光度(OD600)檢測。

發(fā)酵液中殘余的葡萄糖及合成的有機酸采用高效液相分析儀(HPLC)檢測。檢測方法：取1 mL發(fā)酵液，13 000 r/min離心2 min留取上清。將上清液過膜處理后，開始進行色譜分離。色譜分離條件：色譜柱為AminexRRHPX-87H(300 mm×7.8 mm)，流動相為5 mmol/L H2SO4，柱溫為30 ℃，檢測波長為215 nm，流動相總流速為0.5 mL/min，采用等濃度洗脫的方法。

蘇氨酸采用高效液相分析儀(HPLC)柱前衍生測定。衍生方法：取1 mL發(fā)酵液，13 000 r/min離心2 min留取上清。在1.5 mL離心管中加入200 μL衍生緩沖液(42%(質(zhì)量分數(shù))NaHCO3溶液)，加入10 μL 發(fā)酵液混勻后，再加入衍生試劑溶液(1%(質(zhì)量分數(shù))2，4-二硝基氟苯乙腈溶液)300 μL搖勻，將離心管置于65 ℃水浴鍋中反應1 h后取出。將樣品冷卻至室溫后，加入定容緩沖液(68%(質(zhì)量分數(shù))KH2PO4溶液)690 μL搖勻，然后將樣品過膜處理，開始進行色譜分離。色譜分離條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm × 150 mm，5 mm)，流動相為乙腈-乙酸鈉緩沖液，柱溫為33 ℃，檢測波長為360 nm，流動相總流速為1 mL/min， 采用二元梯度洗脫的方法。

1.7 總RNA的提取和實時熒光定量PCR

根據(jù)aceE、dcas9和E.coliW3110 16S rDNA(rrnb，內(nèi)參)基因序列采用Premier 5.0 軟件設計用于RT-PCR的引物。發(fā)酵培養(yǎng)10 h取樣，并參照Promega試劑盒說明書要求提取RNA，參照RR036A試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR體系及方法參照SYBRR Premix EX-Taq TM Ⅱ試劑盒說明書。首先擴增目的基因和內(nèi)參基因，通過分析擴增曲線指數(shù)增長期的平行性來確定擴增倍數(shù)作為后續(xù)實驗的標準，然后對菌株的目的基因和內(nèi)參基因進行定量測定(每個樣本3個重復)，并用ΔΔCt法分別計算基因aceE和dcas9相對轉(zhuǎn)錄量。ΔΔCt法計算流程：步驟一，內(nèi)參基因均一化樣品差異，即Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)= ΔCt；步驟二，實驗樣品和對照樣品比較，即ΔCt(實驗樣品)- ΔCt(對照樣品)= ΔΔCt；步驟三，使用公式計算，即倍數(shù)變化=2-ΔΔCt，式中Ct(循環(huán)閾值)即PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的熒光閥值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。

1.8 發(fā)酵數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值和標準偏差。利用T檢驗雙尾分布對2組發(fā)酵參數(shù)進行單向方差分析。0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 阿拉伯糖誘導代謝干擾系統(tǒng)的構(gòu)建

目前，有關(guān)CRISPRi干擾技術(shù)的研究均采用dcas9基因和sgRNA共表達體系，該體系通過單質(zhì)粒表達實現(xiàn)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平的目的。但由于dcas9基因過大，采用單質(zhì)粒過表達的方式，會增加菌體生長負擔。為了減輕干擾系統(tǒng)引入對細胞生長的影響，本實驗首先構(gòu)建了一套基于阿拉伯糖誘導的干擾體系。利用CRISPR/Cas9基因編輯方法，以蘇氨酸工程菌E.coliTHRD為出發(fā)菌，將dcas9基因整合在基因組的araB、araA、araD基因位置位點，受控于阿拉伯糖啟動子Para。在代謝工程研究中，通過誘導調(diào)控基因表達是常用的改造策略，常用的誘導劑有乳糖、木糖、四環(huán)素和阿拉伯糖等。比較而言，阿拉伯糖誘導具有嚴緊性以及對菌體沒有毒害作用的特點[25]。隨后為了減少葡萄糖對阿拉伯糖啟動子的阻遏，根據(jù)文獻報道[26]，對mlc基因啟動子-10區(qū)進行點突變，解除葡萄糖效應，構(gòu)建了菌株THRD-1。最后，將干擾特定基因的sgRNA連接到質(zhì)粒pGRB上，通過電轉(zhuǎn)導入THRD-1菌株中，構(gòu)建相應的干擾菌株。

2.2 阿拉伯糖誘導條件下的代謝干擾體系測試

為了測試代謝干擾體系的可行性和阿拉伯糖誘導的嚴緊性，本實驗構(gòu)建了干擾aceE基因的pGRB質(zhì)粒，并導入菌株THRD-1，檢測阿拉伯糖誘導條件下的aceE基因和dcas9基因轉(zhuǎn)錄水平變化。前期研究報道[27]，sgRNA設計與非模板鏈DNA鏈結(jié)合有較高的靶向效率，與模板鏈結(jié)合的sgRNA僅表現(xiàn)出較弱的靶向效率，且sgRNA靶向基因的ATG區(qū)域效果優(yōu)于啟動子區(qū)域，sgRNA靶向啟動子區(qū)域與編碼區(qū)中部效率相當。為了研究不同區(qū)域的sgRNA對基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，針對aceE基因構(gòu)建了3個不同的靶向sgRNA序列，分別為aceE基因非模板鏈的ATG區(qū)域、編碼區(qū)中部區(qū)域和編碼區(qū)尾部區(qū)域(圖1-A)。

通過RT-PCR對阿拉伯糖誘導條件下的基因dcas9進行轉(zhuǎn)錄分析，未誘導條件下dcas9基因的轉(zhuǎn)錄量定為1，經(jīng)阿拉伯糖誘導后的dcas9表達量是未誘導條件下的233倍(圖1-B)，說明阿拉伯糖可以有效地誘導dcas9的表達。隨后對阿拉伯糖誘導條件下的基因aceE進行轉(zhuǎn)錄分析，結(jié)果如圖1-C所示。

A-sgRNA靶向基因aceE不同位置示意圖；B-不同培養(yǎng)條件下，基因dcas9相對轉(zhuǎn)錄；C-不同的培養(yǎng)條件和干擾位置，基因aceE相對轉(zhuǎn)錄量NI-未添加阿拉伯糖；I-添加阿拉伯糖圖1 阿拉伯糖誘導干擾體系測試Fig.1 Test of arabinose-induced interference system

對照菌株THRD-1(pGRB)中基因aceE的轉(zhuǎn)錄量定為1，菌株THRD-1(pGRB-aceE1) 在未誘導條件下基因aceE轉(zhuǎn)錄量沒有降低，說明了阿拉伯糖誘導系統(tǒng)的嚴緊性。在阿拉伯糖誘導條件下，干擾ATG區(qū)域的菌株THRD-1(pGRB-aceE1)和干擾編碼區(qū)中部區(qū)域的菌株THRD-1(pGRB-aceE2)中，基因aceE的轉(zhuǎn)錄量分別降低了77.78%和74.56%，干擾編碼區(qū)尾部區(qū)對基因aceE轉(zhuǎn)錄沒有效果。由此可以看出，抑制基因aceE轉(zhuǎn)錄強弱的順序依次為：ATG區(qū)域、編碼區(qū)中部區(qū)域和編碼區(qū)尾部區(qū)域，與文獻報道一致[28]。

2.3 干擾中心代謝基因?qū)μK氨酸生產(chǎn)的影響

由圖1的結(jié)果可以看出，利用基于阿拉伯糖誘導的CRISPRi干擾體系可以有效地調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。為了提高蘇氨酸的合成效率，本實驗選擇了中心代謝的關(guān)鍵基因zwf、pfkA、pykF、pck、aceE、gltA、sucA、sucC和sucD為干擾對象，分析9個基因的轉(zhuǎn)錄水平變化對蘇氨酸合成的影響。每個靶向基因選擇2個不同的干擾區(qū)域以實現(xiàn)不同的抑制水平，干擾的位置分別為對應基因的ATG區(qū)域和編碼區(qū)中部區(qū)域。構(gòu)建相應的干擾質(zhì)粒并導入THRD-1，搖瓶發(fā)酵24 h，測定菌體生物量、葡萄糖消耗和蘇氨酸產(chǎn)率，結(jié)果如表2所示。

表2 干擾中心代謝不同基因的菌株蘇氨酸發(fā)酵結(jié)果Table 2 Results of threonine fermentation with strains by interfering different central metabolic genes

注：*表示0.01

發(fā)酵結(jié)果顯示，干擾pykF、pck、aceE、sucA、sucC和sucD基因的轉(zhuǎn)錄對菌株產(chǎn)酸和糖酸轉(zhuǎn)化率方面沒有明顯的提升，說明干擾上述基因并不能提高蘇氨酸生產(chǎn)菌的產(chǎn)酸效率。干擾zwf、pfkA和gltA基因?qū)μK氨酸的產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率都有不同程度的提高，這也證明可以采用CRISPRi技術(shù)來篩選對蘇氨酸合成具有正向效果的基因。

zwf基因是葡萄糖6-磷酸進入HMP途徑的關(guān)鍵基因，而HMP途徑是蘇氨酸合成的支路途徑和生成CO2的主要途徑。調(diào)節(jié)zwf基因的表達水平可以減緩HMP途徑的代謝速率，減少碳源流失，使更多的碳源流向蘇氨酸。干擾zwf基因的ATG區(qū)域和編碼區(qū)中部區(qū)域，對應菌株蘇氨酸產(chǎn)量分別為60.3和60.1 g/L，與對照菌株(50.9 g/L)相比，分別提高了18.5%和18.1%。發(fā)酵培養(yǎng)24 h，兩者消耗葡萄糖的量均為150 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率均為40%。

pfkA基因是EMP途徑的關(guān)鍵基因，該基因編碼的6-磷酸葡萄糖激酶是EMP途徑的限速酶，調(diào)節(jié)pfkA基因的轉(zhuǎn)錄水平，使EMP途徑代謝速率變緩，減緩中心代謝速率，優(yōu)化代謝網(wǎng)絡，提高蘇氨酸合成效率。干擾pfkA基因的ATG區(qū)域和編碼區(qū)中部區(qū)域，對應菌株蘇氨酸產(chǎn)量分別為64.6和63.6 g/L，與對照菌株(50.9 g/L)相比，分別提高了26.9%和25.0%。發(fā)酵培養(yǎng)24 h，消耗葡萄糖的質(zhì)量濃度為170 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率分別為38%和37%，與對照菌株34%相比分別提高了11.8%和8.8%。

gltA基因是乙酰輔酶A進入TCA循環(huán)的關(guān)鍵基因，調(diào)節(jié)gltA基因的轉(zhuǎn)錄水平，減緩TCA循環(huán)的代謝速率，進入TCA循環(huán)的草酰乙酸相對減少，更多的草酰乙酸進入蘇氨酸合成途徑，使蘇氨酸的產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率有一定程度的提高。干擾gltA基因的ATG區(qū)域和編碼區(qū)中部區(qū)域，對應菌株的蘇氨酸產(chǎn)量分別為65.8和63.6 g/L，與對照菌株(50.9 g/L)相比，分別提高了29.3%和25.0%。發(fā)酵培養(yǎng)24 h，消耗葡萄糖質(zhì)量濃度為170 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率分別為39%和37%，與對照菌株(34%)相比，分別提高了14.7%和8.8%。

依據(jù)上述結(jié)果分析，調(diào)節(jié)zwf、pfkA和gltA基因的表達水平，對應菌株的蘇氨酸產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率都有一定程度的提高。對同一基因而言，干擾基因ATG區(qū)域?qū)木暝谔K氨酸產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率方面均優(yōu)于干擾基因編碼區(qū)中部區(qū)域的菌株。對不同基因而言，調(diào)節(jié)pfkA和gltA基因的轉(zhuǎn)錄水平，均提高了蘇氨酸的產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率，且兩者提升的幅度相同。雖然兩者減緩了中心代謝速率，重新平衡了代謝網(wǎng)絡，但重新平衡代謝網(wǎng)絡后的菌株對葡萄糖的需求量有所增加，導致兩者在糖酸轉(zhuǎn)化率方面的提升幅度不及產(chǎn)酸方面。相比pfkA和gltA基因，調(diào)節(jié)zwf基因的轉(zhuǎn)錄水平，雖然在蘇氨酸產(chǎn)率方面不及前兩者，但由于在發(fā)酵培養(yǎng)過程中消耗葡萄糖的量相對較少，所以在蘇氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率方面優(yōu)于前者。同時，表2中菌株的OD600與對照菌株差別不大，表明調(diào)節(jié)基因的表達水平對菌體的生長沒有顯著影響。

3 結(jié)論

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，調(diào)節(jié)合成代謝途徑基因的表達水平，優(yōu)化合成代謝網(wǎng)絡變得越來越重要。傳統(tǒng)代謝工程研究中，為了增加目標產(chǎn)品的積累，通常通過刪除相關(guān)基因，阻斷支路途徑來減少中間產(chǎn)物的消耗。然而，如果缺失的基因是必需的，細胞就會死亡或嚴重影響細胞生長。CRISPRi技術(shù)在轉(zhuǎn)錄層面調(diào)節(jié)目標基因的表達，避免了傳統(tǒng)基因敲除方法的缺點，可以在不影響細胞生長的情況下調(diào)整和優(yōu)化產(chǎn)物的合成代謝網(wǎng)絡。

為了提高蘇氨酸合成效率，本研究在蘇氨酸工程菌建立了基于阿拉伯糖誘導CRISPRi干擾體系，并系統(tǒng)分析了中心代謝中關(guān)鍵基因表達水平的調(diào)節(jié)對蘇氨酸合成的影響。結(jié)果表明，在阿拉伯糖的誘導條件下，通過調(diào)節(jié)zwf、pfkA和gltA基因轉(zhuǎn)錄水平，可以顯著提高蘇氨酸的產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率。本研究為構(gòu)建更高效的蘇氨酸工程菌奠定了理論基礎，也為其他生物制品的工程菌構(gòu)建提供了實踐參考。進一步的研究中，可以通過CRISPRi同時干擾多個靶基因，對蘇氨酸合成代謝網(wǎng)絡進行更好的調(diào)控，進一步提高蘇氨酸產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率。另外，還可以將對蘇氨酸合成有益的相應sgRNA模塊整合在基因組上，構(gòu)建無質(zhì)粒的工程菌。