計(jì)紅芳，李莎莎，王雪菲，張令文，陳復(fù)生，馬漢軍*

1(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng),453003) 2(食品科學(xué)與工程博士后流動(dòng)站(河南工業(yè)大學(xué))，河南 鄭州,450001)

鹽溶蛋白是一類具有重要生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合體，約占蛋白總量的50%，主要是由肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)球蛋白、原肌球蛋白等構(gòu)成[1]，是影響肉制品品質(zhì)特性的主要肌肉蛋白質(zhì)，例如，它可影響肉制品的乳化特性、質(zhì)構(gòu)特性與感官品質(zhì)[2]。近些年來，豌豆蛋白以極高的營養(yǎng)價(jià)值與保健功能，備受人們關(guān)注。豌豆蛋白中除蛋氨酸含量較低外，其他氨基酸比例相對(duì)較為均衡，基本可稱為全價(jià)蛋白質(zhì)，且具有調(diào)節(jié)腸胃，降低血壓及提高免疫力的功能[3-4]。豌豆蛋白具有良好的溶解性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性等，全部或部分添加，可優(yōu)化成品的營養(yǎng)組成，改善成品質(zhì)構(gòu)，增強(qiáng)其穩(wěn)定性[5-6]。近些年來對(duì)豌豆蛋白的應(yīng)用進(jìn)行了一些研究，豌豆蛋白不僅有助于凝膠的形成，還能促進(jìn)表面疏水性的形成，產(chǎn)生類似脂肪的口感，可作為脂肪替代品生產(chǎn)低能量食品，但與大豆蛋白等相比，在肉制品中的應(yīng)用有限[7]。

馮婷等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)花生濃縮蛋白添加量為2.5%時(shí)，可以明顯改善雞肉鹽溶蛋白凝膠硬度、彈性等[8]。張巍、李先保等把大豆分離蛋白添加到豬肉、兔肉鹽溶蛋白中發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白添加量為20%、4.5% 時(shí)均可改善其凝膠品質(zhì)[9-10]。還有一些學(xué)者報(bào)道，添加豌豆蛋白的香腸，具有更好的質(zhì)構(gòu)與感官品質(zhì)[11-13]，然而以上植物蛋白究竟是如何影響各種肉類鹽溶性蛋白的功能性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響凝膠品質(zhì)的則鮮見相關(guān)報(bào)道。

本課題組前期研究表明，添加質(zhì)量濃度為0.12 g/mL的豌豆蛋白可顯著改善牛肉鹽溶蛋白凝膠的品質(zhì)，但是豌豆蛋白對(duì)牛肉鹽溶蛋白性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律，尚未闡明。因此，本文研究了不同添加量的豌豆蛋白對(duì)牛肉鹽溶蛋白理化性質(zhì)與二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，以及相互結(jié)合的化學(xué)作用力類型，為豌豆蛋白在牛肉凝膠制品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛背最長肌、大豆油，河南省新鄉(xiāng)市易購世紀(jì)華聯(lián)超市；豌豆蛋白，煙臺(tái)東方蛋白科技有限公司。牛血清白蛋白,分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸胍、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、溴酚藍(lán)(bromophenol blue, BPB)、EDTA、DTNB、尿素等，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YP5002型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；AD200L-P型分散均質(zhì)機(jī)，上海昂尼儀器儀表有限公司；TGL-15B高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；WFJ7200型紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；FE28型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DZKW-4恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DYCZ-24DN型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Labram HR800激光拉曼光譜儀，法國Jobin-Yvon公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛肉鹽溶蛋白的提取及與豌豆蛋白混合液的制備

參考CHEN[14]及孔鵬等[15]的方法并稍作修改。取70 g新鮮牛肉剔除脂肪和結(jié)締組織，制成肉糜狀，按1∶3質(zhì)量比加入0.6 mol/L NaCl溶液，勻漿，調(diào)pH值7.0，4 ℃放置24 h，10 000 r/min離心10 min，上清液即為鹽溶性蛋白。

將豌豆蛋白0、1.6、3.2、4.8、6.4、8 g分別添加到40 mL 30 mg/mL的鹽溶蛋白溶液中(豌豆蛋白的質(zhì)量濃度分別為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 g/mL)，均質(zhì)，4 ℃條件下靜置12 h。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清蛋白，雙縮脲法測定混合液的蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.104 2X-0.004，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。凝膠制備參考栗俊廣等[16]的方法。

1.3.2 混合蛋白溶液SDS-PAGE凝膠電泳分析

參照郭堯君[17]和LAEMMLI[18]的方法。采用SDS-PAGE法對(duì)蛋白進(jìn)行電泳分析。

1.3.3 濁度的測定

根據(jù)尚永彪等[19]的方法。取1 mg/mL的混合蛋白溶液，在25 ℃的恒溫水浴鍋中水浴20 min，在340 nm處測量吸光度變化，以吸光度值代表溶液的濁度。

1.3.4 溶解度的測定

參照魏朝貴等[20]的方法。取4 mg/mL的混合蛋白溶液，在4 ℃、1 500×g條件下離心10 min，用雙縮脲法測其上清液的蛋白質(zhì)量濃度，計(jì)算公式如下：

(1)

式中：ρ1為離心后上清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL)；ρ2為離心前的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL)。

1.3.5 表面疏水性的測定

參照CHELH等的方法，并作一定的改進(jìn)[21]。計(jì)算公式如下：

(2)

1.3.6 乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)的測定

參考邵俊花[22]的方法，測定乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index，EAI)、乳化穩(wěn)定性指數(shù)(emulsifying stability index，ESI)。根據(jù)公式(3)、(4)計(jì)算：

(3)

(4)

式中：ΔA為乳狀液初始的吸光度(A0)與靜置5 min后的吸光度(A5)的差；ρ為乳化前混合蛋白溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；φ為乳狀液中大豆油所占的體積分?jǐn)?shù)，%。

1.3.7 二硫鍵含量的測定

參照THANNHAUSER等[23]的方法。取0.5 mL 4 mg/mL的混合蛋白溶液，加入3.0 mL新配NTSB檢測溶液(pH 9.5)，混勻后在暗處反應(yīng)25 min，412 nm處測定吸光值。根據(jù)公式(5)計(jì)算：

(5)

式中：B為稀釋倍數(shù)，此處為1.46；C為混合蛋白溶液濃度。

1.3.8 巰基含量的測定

參照曾憲明等的方法，并略作改變[24]。

總巰基含量的測定除在緩沖液中加入8 mol/L的尿素，其他方法同活性巰基含量的測定。計(jì)算公式為：

(6)

式中：B為稀釋倍數(shù)，此處為1.46；C為混合蛋白溶液濃度。

1.3.9 靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用的測定

參照GOMEZ等[25]的方法并稍作修改。

1.3.10 拉曼光譜的測定

參照YANG等[26]的方法。將激光(配備514.5 nm氬離子激光)聚焦在樣品上，樣品表面的激光功率控制在100 mW左右，光譜的獲得條件：600 g/mm光柵，狹縫200 μm，3次掃描累加，分辨率為2 cm-1，數(shù)據(jù)獲取速度為120 cm-1/min，積分時(shí)間60 s，獲取的拉曼光譜在400～3 600 cm-1。根據(jù)苯丙氨酸環(huán)在1 003 cm-1伸縮振動(dòng)強(qiáng)度作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行歸一化。根據(jù)酰胺I帶的變化，用ALIX的方法計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)、最小顯著差法(least significant difference, LSD)、相關(guān)性分析(pearson)，P<0.05為差異顯著。每組試驗(yàn)除特殊說明外均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合蛋白溶液SDS-PAGE凝膠電泳

鹽溶蛋白是一種混合蛋白，其中最重要的是肌球蛋白，分子質(zhì)量大約為480 kDa，由2條重鏈(約200 kDa)和4條輕鏈(16～25 kDa)組成[27]。豌豆蛋白中大部分蛋白為球蛋白，球蛋白可分為legumin(11S)和vicilin(7S)。11S球蛋白是六聚體(320～380 kDa)，7S球蛋白是三聚體(150～180 kDa)，由相對(duì)分子質(zhì)量為47～50，30～34，<19 kDa的亞基構(gòu)成[28]，此外，豌豆蛋白中還有一類伴豌豆球蛋白(convicilin)[29]，分子質(zhì)量為71～75 kDa，也有文獻(xiàn)將其歸為vicilin的1個(gè)亞基[30]。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白;A-G分別為豌豆蛋白添加質(zhì)量濃度:0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、1 g/mL圖1 豌豆蛋白添加到鹽溶蛋白溶液中SDS-PAGE電泳圖譜

Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of salt-soluble protein solution with different content of pea protein

由圖1推測可知，A泳道對(duì)應(yīng)的條帶1、2、4、6、7、8、9依次為肌球蛋白重鏈、C-蛋白、α-肌動(dòng)素、肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C；G泳道對(duì)應(yīng)的條帶3、6、10均為vicilin(7S)的亞基，5、7、9依次為伴豌豆球蛋白、legA(11S)、legB(11S)。隨豌豆蛋白添加量的增加，條帶3、5、10為豌豆蛋白的vicilin(7S)亞基和伴豌豆球蛋白，逐漸變粗顏色加深。6、7、9條帶的變粗與顏色變深，可能是由于豌豆蛋白中的vicilin(7S)亞基、legA和legB與鹽溶性蛋白中的肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C結(jié)合所致。

2.2 豌豆蛋白添加量對(duì)鹽溶蛋白濁度和溶解度的影響

濁度的大小可以反映蛋白聚集程度，并可檢測蛋白相互作用程度及蛋白聚集體相對(duì)尺寸[31]。由圖2可知，鹽溶性蛋白的濁度整體呈上升趨勢，可能是因?yàn)橥愣沟鞍滋砑恿康脑黾邮雇愣沟鞍着c鹽溶蛋白形成的聚集體進(jìn)一步增大，顆粒直徑變大，濁度升高。

圖2 豌豆蛋白添加量對(duì)鹽溶蛋白濁度的影響

Fig.2 Effect of pea protein addition on turbidity of salt-soluble protein

溶解性是蛋白質(zhì)變性程度的一個(gè)重要參數(shù)。由圖3可知，豌豆蛋白的添加量不同，對(duì)鹽溶蛋白的溶解度產(chǎn)生的影響也不同。當(dāng)添加質(zhì)量濃度為0.04 g/mL時(shí)，溶解度上升至最大，為45.26%，隨后開始下降，可能是因?yàn)檫^量的豌豆蛋白阻礙了鹽溶蛋白與水分子結(jié)合的能力，樣品處理過程中表面疏水集團(tuán)暴露，疏水相互作用增強(qiáng)，也可使蛋白質(zhì)溶解度進(jìn)一步降低。

圖3 豌豆蛋白添加量對(duì)鹽溶蛋白溶解度的影響

Fig.3 Effect of pea protein addition on solubility of salt- soluble protein

2.3 豌豆蛋白添加量對(duì)鹽溶蛋白表面疏水性的影響

表面疏水作用力在維持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白構(gòu)象及功能特性等方面起著非常重要的作用[32]。由圖4可知，被結(jié)合的BPB含量即鹽溶蛋白的表面疏水性隨著豌豆蛋白添加量的增加呈上升趨勢，當(dāng)添加量為0.08 g/mL時(shí)，迅速上升(P<0.05)，與對(duì)照相比，上升了76.25%；當(dāng)添加量大于0.08 g/mL，上升較為緩慢;添加量為0.20 g/mL時(shí)，表面疏水性最大，與其他添加量相比，差異顯著(P<0.05)?？赡苁且?yàn)闃悠吩谔幚磉^程中,蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露，引起溴酚藍(lán)與蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸殘基的結(jié)合量增加，從而使表面疏水性增加。

圖4 豌豆蛋白添加量對(duì)鹽溶蛋白表面疏水性的影響

Fig.4 Effect of pea protein addition on surface hydropho-bicity of salt-soluble protein

2.4 豌豆蛋白添加量對(duì)鹽溶蛋白EAI和ESI的影響

由圖5可知，鹽溶蛋白的EAI和ESI均隨著豌豆蛋白添加量的增加呈上升趨勢。豌豆蛋白在添加質(zhì)量濃度為0.04～0.12 g/mL時(shí)，增長較為明顯(P<0.05)；添加質(zhì)量濃度0.16～0.20 g/mL時(shí)，差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)豌豆蛋白添加量較低時(shí)，蛋白液中的蛋白分子間距較大，單個(gè)蛋白分子有效乳化表面積較高，使得乳化活性增加較快，隨著豌豆蛋白添加量持續(xù)增加，蛋白分子逐漸聚集，形成了比較穩(wěn)定的乳化狀態(tài)。

圖5 豌豆蛋白添加量對(duì)鹽溶蛋白EAI和ESI的影響

Fig.5 Effect of pea protein addition on EAI and ESI of salt-soluble protein

2.5 豌豆蛋白添加量對(duì)鹽溶蛋白二硫鍵含量和巰基含量的影響

二硫鍵直接影響著蛋白質(zhì)折疊的速率和途徑，對(duì)于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和保持一定的活性功能具有很重要作用[33]，巰基是蛋白分子活性基團(tuán)的關(guān)鍵部位，其含量的變化對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)影響較大。結(jié)合圖6和圖7，鹽溶蛋白中的總巰基和表面活性巰基含量均呈下降趨勢，且均在豌豆蛋白添加質(zhì)量濃度為0.04～0.12 g/mL時(shí)，下降較為緩慢(P>0.05)，之后下降迅速；二硫鍵含量呈上升趨勢。這可能是由于豌豆蛋白與鹽溶蛋白相互作用，并經(jīng)過劇烈均質(zhì)，使隱藏在鹽溶蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部的巰基暴露，分子間和分子內(nèi)通過交聯(lián)形成二硫共價(jià)鍵，使得二硫鍵含量增加，暴露的巰基含量減少。

圖6 豌豆蛋白添加量鹽溶蛋白二硫鍵含量的影響

Fig.6 Effect of pea protein addition on disulfide bonds content of salt-soluble protein

圖7 豌豆蛋白添加量對(duì)鹽溶蛋白巰基含量的影響

Fig.7 Effect of pea protein addition on sulfhydryl content of salt-soluble protein

2.6 豌豆蛋白添加量對(duì)共混凝膠形成過程中化學(xué)作用力的影響

氫鍵、靜電作用及疏水作用是維持蛋白凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最主要的作用力[34]。從圖8可知，凝膠的靜電作用、氫鍵所對(duì)應(yīng)的蛋白溶解量差，都<1 mg/mL，表明二者均不是維持豌豆蛋白與鹽溶蛋白共混熱誘導(dǎo)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)作用力。

圖8 豌豆蛋白對(duì)凝膠形成過程中化學(xué)作用力的影響

Fig.8 Effect of pea protein on chemical forces during gel formation

隨豌豆蛋白添加質(zhì)量濃度的增加，凝膠的疏水相互作用力呈上升趨勢，在添加質(zhì)量濃度為0.08 g/mL時(shí)，疏水作用最強(qiáng)，是對(duì)照組的2.11倍，表明添加豌豆蛋白明顯增強(qiáng)了凝膠的疏水相互作用力。這可能是由于豌豆蛋白與鹽溶蛋白發(fā)生相互作用，改變了鹽溶蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，促進(jìn)了蛋白分子的解聚和伸展，使包埋的非極性多肽基團(tuán)充分地暴露出來，從而增強(qiáng)了共混凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.7 豌豆蛋白添加量對(duì)共混凝膠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)影響

拉曼光譜中酰胺I帶處振動(dòng)與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，包括高α-螺旋含量的酰胺I帶振動(dòng)主要集中在(1 655±5)cm-1處，高β-折疊含量的酰胺I帶振動(dòng)主要集中在(1 670±5)cm-1，β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲主要集中在1 680 cm-1和(1 665±5)cm-1[35]。據(jù)報(bào)道，加熱升溫會(huì)使α-螺旋結(jié)構(gòu)解開而逐漸減少，β-折疊逐漸增加，有序結(jié)構(gòu)總體減少，無序結(jié)構(gòu)總體增加[36]。由表1可知，隨豌豆蛋白添加量的增加，α-螺旋含量逐漸下降，對(duì)照含量為62.36%，添加質(zhì)量濃度為0.20 g/mL時(shí)，α-螺旋含量最低為49.26%，但與0.12和0.16 g/mL的添加量相比，差異不顯著(P>0.05)；β-折疊含量持續(xù)增加，由對(duì)照的14.77% 增加到添加質(zhì)量濃度為0.20 g/mL的22.42%，增加了7.65%，添加質(zhì)量濃度在0.08～0.12 g/mL時(shí)，β-折疊含量彼此差異不顯著(P>0.05)；β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲含量也呈上升趨勢，分別由對(duì)照的12.5%、10.79% 增加到添加質(zhì)量濃度為0.20 g/mL的15.88%、14.03%。WU等[37]研究發(fā)現(xiàn)，肌肉中α-螺旋結(jié)構(gòu)越多，越有利于蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)越多，蛋白自由度越高，變性程度越大。在加熱條件下，α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊，其含量下降表征蛋白分子變性程度增加，β-折疊含量增加表征蛋白分子間聚集程度增加，而β-折疊結(jié)構(gòu)是蛋白聚集和形成良好凝膠的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)[38]。

表1 添加豌豆蛋白對(duì)共混凝膠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響

注：同一列中不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)。

2.8 豌豆蛋白的添加對(duì)各指標(biāo)影響的相關(guān)性分析

由表2可知，豌豆蛋白添加質(zhì)量濃度與α-螺旋、總巰基、表面活性巰基含量、溶解度均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲、二硫鍵含量、表面疏水性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性、濁度均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，表明豌豆蛋白可以顯著影響牛鹽溶蛋白的理化性質(zhì)。加熱過程促進(jìn)了鹽溶性蛋白的變性與聚集，降低了α-螺旋含量，增加了β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等含量，實(shí)現(xiàn)了蛋白從有序到無序的轉(zhuǎn)變。表面疏水性、疏水相互作用均與凝膠α-螺旋含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；二硫鍵與α-螺旋含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而與β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，表明表面疏水性、疏水相互作用、二硫鍵等顯著影響蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。β-折疊結(jié)構(gòu)是蛋白集聚和形成良好凝膠的基礎(chǔ)，疏水相互作用、二硫鍵是形成凝膠的主要化學(xué)作用力[38-39]，添加豌豆蛋白，有利于牛鹽溶蛋白良好凝膠結(jié)構(gòu)的形成。

表2 添加豌豆蛋白的各指標(biāo)相關(guān)性

3 結(jié)論

在SDS-PAGE電泳中，牛肉鹽溶性蛋白中的肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白C分別與豌豆蛋白中的vicilin(7S)亞基、legA和legB結(jié)合，因此條帶隨著豌豆蛋白添加量的增加逐漸變粗且顏色加深；濁度、表面疏水性、二硫鍵含量、乳化性均隨著豌豆蛋白添加量的增加呈現(xiàn)上升趨勢，且乳化活性和乳化穩(wěn)定性均在添加質(zhì)量濃度為0.04～0.12 g/mL時(shí)，迅速上升；溶解度在添加質(zhì)量濃度為0.04 g/mL時(shí)達(dá)到最大；總巰基和表面活性巰基變化趨勢一致，均呈下降趨勢；豌豆蛋白添加量與α-螺旋、總巰基、表面活性巰基含量、溶解度均呈顯著負(fù)相關(guān)，與β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲、二硫鍵含量、表面疏水性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性、濁度均呈顯著正相關(guān)；疏水相互作用是凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成最主要的化學(xué)作用力。