邵玉倩，宗原，劉以安，劉登峰*

1(江南大學(xué) 物聯(lián)網(wǎng)工程學(xué)院，江蘇 無錫,214122) 2(輕工過程控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

熱凝膠多糖是農(nóng)桿菌(Agrobacteriumsp.) ATCC31749發(fā)酵產(chǎn)生的一種重要的高分子量均一線性胞外多糖[1]，因其特有的凝膠功能，在食品和制藥行業(yè)具有十分廣泛的應(yīng)用。隨著凝膠多糖在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的重要性日益提高，專家們一直致力于通過提高發(fā)酵效價(jià)來降低凝膠多糖的生產(chǎn)成本。目前在發(fā)酵過程中已經(jīng)提出了多種策略來提高發(fā)酵效價(jià)：(1)控制pH值。如LEE等[2]通過控制pH值以遵循最佳分布，并通過反饋?zhàn)顑?yōu)控制實(shí)現(xiàn)凝膠多糖產(chǎn)量的最大化；(2)構(gòu)建基因工程菌株。如SHIN等[3]使用強(qiáng)有力的啟動(dòng)子和工程菌株將纖維二糖高效地轉(zhuǎn)化為凝膠多糖，以及YU等[4]證實(shí)，crdR可通過激活其生物合成基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)凝膠多糖合成；(3)添加輔因子和更換廉價(jià)底物。如WEST等通過以濃縮玉米蒸餾液為底物[5]和添加嘧啶堿[6]來提高凝膠多糖的產(chǎn)量。

新近研究表明，在熱凝膠發(fā)酵過程中，溶氧濃度(dissolved oxygen tension, DOT)不僅影響細(xì)胞生長速率、死亡速率而且對(duì)產(chǎn)物凝膠多糖和副產(chǎn)物合成均有重要影響[1]。因此，如何選擇合適的溶氧過程控制已經(jīng)成為強(qiáng)化凝膠多糖產(chǎn)物合成的關(guān)鍵途徑之一，而建立以溶氧為輸入變量的高精度熱凝膠發(fā)酵控制模型，對(duì)指導(dǎo)以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物最大化的溶氧過程控制優(yōu)化具有重要的意義。因此，建立基于溶氧濃度為關(guān)鍵輸入變量的高精度發(fā)酵產(chǎn)物濃度預(yù)測模型亟需進(jìn)行研究。

發(fā)酵模型分為白箱模型、黑箱模型和灰箱模型。白箱模型(即機(jī)理模型)[7-12]能夠清楚地反映出發(fā)酵過程中生物量與一些輔助變量之間的關(guān)系，展現(xiàn)出發(fā)酵過程的主要框架，但模型精度不高。黑箱模型(即經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?[13-18]根據(jù)對(duì)象的輸入輸出數(shù)據(jù)，利用智能計(jì)算方法直接建模，結(jié)構(gòu)簡單，非線性擬合能力強(qiáng)，但由于黑箱模型不考慮發(fā)酵過程機(jī)理知識(shí)，過于依賴訓(xùn)練數(shù)據(jù)，容易造成模型過擬合，且模型泛化能力弱，不具有可解釋性。為了克服這些缺點(diǎn)，灰箱模型應(yīng)運(yùn)而生?；蚁淠Ｐ?即混合模型)是結(jié)合了機(jī)理模型和經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膬?yōu)點(diǎn)而建立的模型。GHOVVATI等[19]用遺傳算法和粒子群算法進(jìn)行混合來估計(jì)動(dòng)力學(xué)模型中的參數(shù)，董亞明[20]基于雙神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與機(jī)理模型混聯(lián)建立了發(fā)酵過程混合模型，桑海峰[21]、黎興寶等[22]均是基于機(jī)理知識(shí)和最小二乘支持向量機(jī)建立了混合發(fā)酵模型。

而在農(nóng)桿菌發(fā)酵法產(chǎn)凝膠多糖的溶氧優(yōu)化方面，ZHANG等[1]在Logistic方程和Luedeking-Piret方程的基礎(chǔ)上用Runge-Kutta法來求解動(dòng)力學(xué)模型，并用遺傳算法來尋找模型參數(shù)，根據(jù)模型參數(shù)與溶氧濃度的關(guān)系建立以溶氧體積分?jǐn)?shù)預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物濃度的模型，但是該模型求解方法計(jì)算量大，求解精度有待提高。針對(duì)該問題，本文在ZHANG等建立的機(jī)理模型的基礎(chǔ)上，首先通過添加模糊加權(quán)思想和混合核函數(shù)方法對(duì)最小二乘支持向量機(jī)(least squares support vector machine, LSSVM)算法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)；然后用改進(jìn)的LSSVM算法求解機(jī)理模型的動(dòng)力學(xué)方程，實(shí)現(xiàn)混合建模；最后對(duì)建立的混合模型實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵控制變量的單一化，并進(jìn)行了以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物濃度最大化為目的的溶氧過程控制曲線優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌株

本文所用的微生物農(nóng)桿菌(Agrobacteriumsp.) ATCC31749來源于江南大學(xué)生物工程學(xué)院。

1.2 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)種子發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖、酵母浸膏、KH2PO4、MgSO4，pH 7.0～7.2。

分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖、酵母提取液、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl，還包含少量微量元素(NaCl、CaCl2、MnCl2、FeCl3·H2O)。

1.3 培養(yǎng)方法

將500 mL培養(yǎng)瓶中的100 mL種子發(fā)酵培養(yǎng)基接種于土壤桿菌(Agrobacteriumsp.) ATCC31749培養(yǎng)物中，初始pH 7.0～7.2，溫度為30 ℃，然后在200 r/min振蕩18 h。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在7 L攪拌槽發(fā)酵罐中進(jìn)行，攪拌速率為400 r/min，在細(xì)胞生長階段pH值維持在7.0，當(dāng)?shù)幌耐陼r(shí)調(diào)整pH值為5.5，溫度為30 ℃。

1.4 不同溶氧濃度下菌株發(fā)酵

在發(fā)酵過程中通過使用氧電極的方式分別控制溶氧體積分?jǐn)?shù)維持在15%，30%，45%，60%和75%并分批做實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)環(huán)境與1.3中相同。

2 發(fā)酵產(chǎn)物濃度預(yù)測的混合建模

為從溶氧控制角度優(yōu)化發(fā)酵過程，實(shí)現(xiàn)提高凝膠多糖產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本，本文針對(duì)文獻(xiàn)[1]中模型精度不高的問題，采用融合建模策略，來實(shí)現(xiàn)高精度預(yù)測模型的建立?？傮w思路是首先建立機(jī)理模型，在文中為微分方程組，然后將微分方程作為LSSVM的約束方程求出生物量濃度、氮濃度、葡萄糖濃度和多糖產(chǎn)量隨時(shí)間變化的情況。分別用溶氧體積分?jǐn)?shù)為15%、30%、45%、60%和75%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練，用鳥群算法尋找不同溶氧體積分?jǐn)?shù)下的最優(yōu)參數(shù)值，分析出溶氧體積分?jǐn)?shù)與模型參數(shù)之間的關(guān)系，然后用溶氧體積分?jǐn)?shù)作為輸入變量建立由溶氧體積分?jǐn)?shù)預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物濃度的模型，最后用鳥群算法尋找最優(yōu)溶氧體積分?jǐn)?shù)，使得多糖產(chǎn)物濃度最大(圖1)。

圖1 混合模型結(jié)構(gòu)流程圖

Fig.1 Mixed model structure flow chart

2.1 機(jī)理模型

農(nóng)桿菌ATCC31749發(fā)酵合成凝膠多糖只有在限氮的條件下才會(huì)進(jìn)行[1]，因此，在農(nóng)桿菌的發(fā)酵過程中，在熱凝膠合成階段，由于缺乏氮源，細(xì)胞的生長受到抑制，葡萄糖主要用來合成多糖和維持細(xì)胞正常的代謝。所以文中機(jī)理模型包括了氮源濃度、葡萄糖濃度、生物量濃度以及多糖產(chǎn)物濃度在發(fā)酵過程中隨時(shí)間變化的關(guān)系(參數(shù)意義見表1)。

表1 模型參數(shù)意義

文中機(jī)理模型是在兩個(gè)假設(shè)的基礎(chǔ)上構(gòu)建的：(1)氮源是細(xì)胞生長過程中的限制性底物；(2)葡萄糖用于細(xì)胞生長、細(xì)胞維持和多糖生物合成。

生物量濃度、氮源濃度、葡萄糖濃度以及多糖產(chǎn)量濃度在發(fā)酵過程中的變化簡述如公式(1)～(4)[1]：

(1)

(2)

(3)

(4)

其中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)表示如下：

(5)

(6)

2.2 LSSVM的混合核函數(shù)

對(duì)LSSVM而言，采用不同的核函數(shù)所建立的LSSVM的性能是不同的，因此核函數(shù)的選擇至關(guān)重要。核函數(shù)的主要種類為：

線性核函數(shù)：K(x,xi)=xTxi;

多項(xiàng)式核函數(shù)：K(x,xi)=(γxTxi+r)p,γ>0;

σ>0;

Sigmod核函數(shù)：K(x,xi)=tanh(γxTxi+r),γ>0,r>0;

根據(jù)核函數(shù)的特征，可以將核函數(shù)分為局部核函數(shù)和全局核函數(shù)[23-25]。局部核函數(shù)的局部學(xué)習(xí)能力較強(qiáng)，即局部核函數(shù)對(duì)距離測試點(diǎn)周圍小范圍的數(shù)據(jù)影響較大，全局核函數(shù)則相反。由文獻(xiàn)[23-25]可知，上述核函數(shù)中多項(xiàng)式核函數(shù)屬于全局核函數(shù)，徑向基核函數(shù)屬于局部核函數(shù)，且基本核函數(shù)的線性組合仍為核函數(shù)，因此，本文采取的核函數(shù)為多項(xiàng)式核函數(shù)與徑向基核函數(shù)的線性組合。

ε∈[0,1]σ>0,γ>0

(7)

對(duì)上述核函數(shù)求偏導(dǎo)可得：

2.3 模糊加權(quán)LSSVM求解動(dòng)力學(xué)模型

由于發(fā)酵過程的復(fù)雜性和不確定性，不同時(shí)期的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)模型建立的重要性是不同的，因此，本文在模型訓(xùn)練時(shí)對(duì)每個(gè)樣本加入模糊加權(quán)隸屬度μi[26]。對(duì)于文中一階非線性常微分方程，在LSSVM框架下，可將微分方程轉(zhuǎn)化為如下的優(yōu)化問題，以式(1)為例，將式(1)作為LSSVM的約束條件進(jìn)行計(jì)算，具體如下：

s.t.ωTφ′(ti)+b1=f(ti,yi)+ei,i=1,2,kN,

(8)

ωTφ(t1)+b1t1+b=p1,

ωTφ(ti)+b1t1+b+ξi=yi,i=1,2,kN.

(9)

建立拉格朗日函數(shù)如下：

由KKT條件可得：

消去ω、ei和ξi后，整理以上公式如下：

(10)

建立拉格朗日函數(shù)如下：

(11)

(12)

通過解上式方程組可得原非線性常微分方程初值問題的近似解，其形式如下：

(13)

2.4 鳥群算法尋優(yōu)

鳥群算法是在2015年由MENG等提出的模仿自然界鳥群覓食、警戒和飛行行為的群智能算法[27-28]，具有尋優(yōu)精度高,魯棒性好等優(yōu)點(diǎn)。

3 實(shí)驗(yàn)仿真、評(píng)估與應(yīng)用

3.1 農(nóng)桿菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)與仿真

在不同溶氧體積分?jǐn)?shù)下得到的X、N、G和P的預(yù)測值，并與1.4中的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較，用誤差平方和來衡量預(yù)測精度，具體公式如下：

Zall=ZX+ZN+ZG+ZP

(14)

式(14)中：Xi,exp、Ni,exp、Gi,exp以及Pi,exp分別代表農(nóng)桿菌ATCC 31749發(fā)酵過程中生物量濃度、氮濃度、葡萄糖濃度和多糖產(chǎn)量濃度的實(shí)驗(yàn)值，而Xi,sim、Ni,sim、Gi,sim及Pi,sim分別代表動(dòng)力學(xué)模型對(duì)生物量濃度、氮濃度、葡萄糖濃度和多糖產(chǎn)量濃度的預(yù)測值。將文中模型預(yù)測結(jié)果與ZHANG等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2～圖6所示。表2為2種模型的仿真誤差對(duì)比(模型1是文獻(xiàn)[1]中模型，模型2是本文混合模型)。

從圖2～圖6的實(shí)驗(yàn)仿真結(jié)果中可以看出：在不同溶氧體積分?jǐn)?shù)下，文中混合模型即模型2對(duì)生物量、氮、葡萄糖和凝膠多糖質(zhì)量濃度的預(yù)測值均更貼近實(shí)驗(yàn)值。2種模型的誤差對(duì)比如表2所示，從表2中可以看出，本文中建立的混合模型2，其預(yù)測誤差平方和比文獻(xiàn)[1]中誤差平方和的平均值降低了40%。因此，本文中建立的混合模型與已有模型相比，其仿真精度更高。

圖2 15%DOT時(shí)各參數(shù)預(yù)測圖

Fig.2 Prediction of each parameter at 15% DOT

圖3 30%DOT時(shí)各參數(shù)預(yù)測圖

Fig.3 Prediction of each parameter at 30% DOT

表2 兩種模型誤差對(duì)比

3.2 不同溶氧濃度下模型仿真中的參數(shù)取值

圖4 45%DOT時(shí)各參數(shù)預(yù)測圖

Fig.4 Prediction of each parameter at 45% DOT

圖5 60%DOT時(shí)各參數(shù)預(yù)測圖

Fig.5 Prediction of each parameter at 60% DOT

表3 不同溶氧濃度下的模型參數(shù)取值

Table 3 Values of model parameters under different dissolved oxygen concentration

參數(shù)DOT(15%)DOT(30%)DOT(45%)DOT(60%)DOT(75%)μmax/h-10.285 00.284 80.284 4 0.285 00.285 0KN/(g·L-1)0.018 40.018 50.018 50.018 50.018 2kd/[L·(g·h)-1]2.098 7×10-42.152 8×10-42.847 5×10-42.954 9×10-43.264 0×10-4YXN/(g·g-1)1.684 51.709 71.751 01.882 61.778 5YXG/(g·g-1)0.400 00.400 60.400 00.432 00.400 0YPG/(g·g-1)0.596 80.686 10.745 70.799 10.562 5mGlc/[g·(g·h)-1]0.073 90.024 40.013 20.005 00.033 1 βmax/(g·g-1)0.108 80.200 30.224 80.247 90.100 0 KG/(g·L-1)19.164 3 20.511 620.279 521.591 620.570 7kp/(g·L-1)2.516 9×10-42.800 0×10-43.615 1×10-45.957 1×10-41.813 3×10-4

3.3 獲取溶氧優(yōu)化控制曲線

在得到溶氧體積分?jǐn)?shù)和主要模型參數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系后，用溶氧體積分?jǐn)?shù)代替模型參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，從而建立起了由溶氧體積分?jǐn)?shù)預(yù)測發(fā)酵產(chǎn)物濃度的混合模型。表5中列出了文獻(xiàn)[1]中模型在不同溶氧體積分?jǐn)?shù)下的凝膠多糖產(chǎn)物體積分?jǐn)?shù)的仿真預(yù)測值，混合模型的仿真預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值。

圖6 75%DOT時(shí)各參數(shù)預(yù)測圖

Fig.6 Prediction of each parameter at 75% DOT

表4 溶氧濃度與各模型參數(shù)的關(guān)系

Table 4 Relationship between dissolved oxygen concentration and various model parameters

模型參數(shù)模型參數(shù)與溶氧濃度的關(guān)系kd-1.083 7×10-9×O3+1.438 5×10-7×O2-3.445 1×10-6×O+0.000 229 96YXN-6.217 3×10-6×O3+7.859×10-4×O2-0.025 799×O+1.921 4YPG-2.669 1×10-6×O3+2.866 8×10-4×O2-0.007 545 9×O+0.582 32mGlc2.711 1×10-5×O2-0.002 628×O+0.115 3βmax-2.567 9×10-6×O3+1.942 2×10-4×O2+0.000 284 44×O+0.072 86KG-1.860 7×10-5×O3+0.001 498 6×O2+0.018 352×O+18.714 6kp-1.732 8×10-8×O3+2.106 7×10-6×O2-6.991 1×10-5×O+0.000 897 7

表5 不同溶氧濃度下各模型多糖產(chǎn)物濃度預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值

從表5中可以看出,2種模型都能通過溶氧體積分?jǐn)?shù)預(yù)測出凝膠多糖產(chǎn)物濃度且2種模型的最優(yōu)溶氧均為52%，但是模型1的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相差在3左右，而本文所建立的以溶氧為控制參數(shù)的模型2與實(shí)驗(yàn)值相差僅1左右。因此，模型1的預(yù)測精度小于本文所建立的混合模型的預(yù)測精度。

在農(nóng)桿菌發(fā)酵工業(yè)中，如何通過控制溶氧來實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的最大化，是農(nóng)桿菌發(fā)酵控制策略開發(fā)的主要任務(wù)之一。因此，以混合模型為基礎(chǔ)，進(jìn)行了以實(shí)現(xiàn)凝膠多糖產(chǎn)量最大化為目的的最優(yōu)溶氧過程控制策略預(yù)測，結(jié)果如圖7、圖8所示。在圖7所示的溶氧控制模式下，模型仿真的凝膠多糖的產(chǎn)物質(zhì)量濃度為48.85 g/L(圖8-d)。

圖7 溶氧過程控制圖

Fig.7 Dissolved oxygen process control chart

4 結(jié)論

本文使用優(yōu)化后的LSSVM對(duì)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行估計(jì)來提高預(yù)測精度。建立了以溶氧體積分?jǐn)?shù)為輸入控制量的發(fā)酵產(chǎn)物濃度混合預(yù)測模型。從文中實(shí)驗(yàn)仿真結(jié)果中可以看出，LSSVM求解的動(dòng)力學(xué)模型精度比傳統(tǒng)的數(shù)值解法的誤差平均降低40%，以LSSVM為基礎(chǔ)的混合模型的預(yù)測精度約提高2，因此文中混合模型的建立是有效的，模型預(yù)測精度更高。最后用鳥群算法找到使得多糖產(chǎn)物質(zhì)量濃度最大(48.85 g/L)的最優(yōu)溶氧體積分?jǐn)?shù)(52%)。該混合模型為進(jìn)一步通過溶氧優(yōu)化控制來提高多糖發(fā)酵產(chǎn)量提供了新的方向。

圖8 最優(yōu)溶氧時(shí)各參數(shù)值

Fig.8 Parameter value of optimal dissolved oxygen concentration