吳傳超，徐富成，顧秋亞，余曉斌*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫， 214122) 2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

姜黃素(C21H20O6，curcumin,CUR)是從姜科姜黃屬一些植物的根莖中提取的一種天然多酚類化合物[1]，為橙黃色結晶粉末，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑[2]。其結構式中獨特的β-二酮結構，使其具有酮與烯醇式互變異構體[3-4]，在酸性或中性溶液中以酮式結構存在，在堿性溶液中呈紅褐色的烯醇式[5]。因其具有抗氧化作用[6]、抗炎作用[7]、抗腫瘤作用[8]等多種生理生化活性，日益受到國內(nèi)外學者的關注。但水溶性低、生物利用度低、易降解、穩(wěn)定性差[9-12]等特性，限制其在臨床上的廣泛應用。

因此，在保留姜黃素原有藥效的基礎上，通過化學法和微生物法對姜黃素的結構改造以獲得新的衍生物成為近年來研究的熱點[13-14]。

通過對其連接鏈中4個雙鍵不同程度的還原，可以得到相應的加氫衍生物[15]。相比于化學合成法，微生物轉化[16-18]具有反應條件溫和,選擇性強,成本低,環(huán)境友好等特點。MAEHARA SHOJI等[19]從姜黃根莖中分離篩選到1株可制得4種姜黃素衍生物的Diaporthesp.菌株，通過結構鑒定，分別為四氫姜黃素(tetrahydrocurcumin,THC)、六氫姜黃素、(3S,5S)-八氫姜黃素和八氫姜黃素。張維宇等[20]從土壤中分離出1株能夠以姜黃素為底物轉化成四氫姜黃素與六氫姜黃素的酵母菌株。羅楊春[21]利用紅球菌90-4以姜黃素為底物生成六氫姜黃素與八氫姜黃素。目前對于姜黃素的加氫衍生物的研究主要集中在四氫姜黃素[22-23]，尚未見對于其他的加氫衍生物，尤其是二氫姜黃素(dihydrocurcumin, DHC)發(fā)酵方面的研究報道。

本研究以實驗室保藏菌種及不同種類的蜂蜜為樣品，首次篩選得到1株酵母菌，它能夠同時以姜黃素為底物生成二氫姜黃素與四氫姜黃素，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)姜黃素加氫衍生物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種,實驗室菌種庫保藏、不同種類的蜂蜜。

試劑：姜黃素(AR級)、乙腈(色譜純)，國藥集團有限公司；姜黃素標準品，大連生物美侖技術有限公司；二氫姜黃素標準品，武漢天植生物技術有限公司；四氫姜黃素標準品，上海源葉生物科技有限公司；其他實驗所用試劑均為分析純。

篩選培養(yǎng)基[20]:姜黃素2 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO41 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，agar 20 g/L。

固體培養(yǎng)基:YPD、PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基:YPD、PDA液體培養(yǎng)基。

酵母菌基礎發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖40 g/L，蛋白胨2 g/L，姜黃素0.1 g/L，吐溫20 mL/L。

曲霉基礎發(fā)酵培養(yǎng)基:大米粉5 g/L，玉米粉5 g/L，黃豆粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，甘油20 mL/L,NaNO35 g/L，KH2PO42.5 g/L。

1.2 儀器與設備

日立U-3900紫外可見光分光光度計，日本日立株式會社；Agilent-1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質譜聯(lián)用儀，美國沃特世公司；高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 菌種篩選方法

菌種初篩:將實驗室保藏的菌種在篩選培養(yǎng)基(以姜黃素為唯一碳源)中培養(yǎng)3 d，挑選能夠在篩選培養(yǎng)基上生長的單菌落。將1 g不同種類的蜂蜜用無菌水稀釋到10-4～10-6的菌懸液，取100 μL涂布于篩選培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d。觀察菌落的生長狀況，從平板上生長的菌落中挑取各種形態(tài)不一樣的單菌落，置于甘油管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌種復篩：將初篩得到的菌種經(jīng)過基礎發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，采用HPLC檢測產(chǎn)物，通過比對CUR、DHC、THC標準品HPLC的出峰時間和峰面積，確定待檢測菌種能否將底物姜黃素轉化成加氫衍生物及其產(chǎn)率。

1.4 分析檢測方法

1.4.1 樣品前處理方法

將篩選的菌種取固體培養(yǎng)基上單菌落接種至種子液培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min條件下，培養(yǎng)2 d，以10%的接種量接種至基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃、180 r/min條件下，培養(yǎng)3 d。實驗中同時設立菌種對照和底物對照，即轉化體系中只加菌體不加姜黃素和轉化體系中只加入姜黃素不加菌種。轉化反應結束后，將轉化液離心(8 000 r/min，10 min)分離菌體，取上清液，用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并萃取液，于45 ℃減壓蒸餾除去乙酸乙酯，用10 mL的色譜級甲醇溶解，用0.22 μm微孔濾膜過濾得到轉化液，待檢測分析。

1.4.2 CUR、DHC與THC檢測波長的選擇

稱取CUR、DHC和THC標準品(純度≥95%)適量，溶于色譜甲醇，定容得標準溶液。稀釋到適宜的濃度后，在200～600 nm內(nèi)進行全光譜掃描，確定其檢測波長[24]。

1.4.3 液相色譜檢測方法[25]

將轉化液樣品譜圖與底物對照組樣品、菌種對照組樣品和標準品組圖譜進行相互比對，觀察是否出現(xiàn)新的峰。色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，Agilent)。流動相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，30%～60% B，10～12 min，60%～65% B，12～15 min，65%～70% B，15～20 min，70%～100% B)。檢測波長：280 nm(THC與CUR)、370 nm(DHC)，進樣量：15 μL,流速:1 mL/min，檢測溫度：30 ℃。

1.4.4 液質聯(lián)用測定方法

轉化液使用UPLC-Q-TOF SYNAPT MS(美國Waters公司)進一步測定，分析軟件為Mass Lynx V4.3。色譜條件：色譜儀為Waters Acquity UPLC；檢測器為Waters Acquity PDA；檢測波長：200～600 nm；柱溫：45 ℃；流速：0.3 mL/min；流動相：A-100%甲醇，B-0.1%甲酸。質譜條件：電噴霧離子源：負離子電離模式(ESI-)；離子源溫度, 100 ℃；脫溶劑溫度, 400 ℃；毛細管電壓, 3 kV；錐孔電壓, 20 V；碰撞能量6 V；選擇離子掃描范圍m/z20～1 000。

1.5 產(chǎn)率的計算

(1)

式中：C，濃度，mol/L;M,摩爾質量。

2 結果

2.1 篩選培養(yǎng)基的結果

按照1.3的方法，在篩選培養(yǎng)基(以CUR為唯一碳源)能夠生長的菌種有83株，其中酵母菌種有52株，曲霉菌種有31株。

2.2 高效液相復篩結果

采用HPLC測定83株菌種轉化液中是否含有DHC與THC。結果如圖1所示，能夠通過轉化DHC與THC的菌種有5株(其中酵母菌種有3株、曲霉菌種有2株)，只產(chǎn)DHC有3株，只產(chǎn)TCH有5株。菌株ISO344的姜黃素轉化率最優(yōu)，DHC為10.49%,THC為13.67%。選取ISO344菌株作為目的菌種。

圖1 菌株對姜黃素的生物轉化率

Fig.1 Biotransformation rate of curcumin by strain

2.3 HPLC高效液相色譜法分析產(chǎn)物

2.3.1 DHC與THC標準曲線的繪制

準確稱取5 mg DHC與THC標準品分別溶于10 mL色譜甲醇，稀釋到不同質量濃度的標準液(0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 g/L)，每組重復3次，檢測各自的質量濃度與峰面積的線性關系，DHC的標準方程為Y

=16 092X+15.016，相關系數(shù)R2=0.999 3，出峰時間為10.973 min。THC的標準方程為Y=28 922X+63.919，相關系數(shù)R2=0.999 8，出峰時間為10.558 min。

2.3.2 菌種ISO344轉化液高效液相的結果

分別將處理后菌種ISO344的樣品組、底物對照組、菌種對照組的轉化液進行HPLC進一步鑒定，如圖2右邊所示，樣品組(圖2-A)在10.963 min處出峰，與DHC標準品(圖2-D)、CUR標準品(圖2-E)基本吻合，底物對照組與菌種對照組在該時間點均未出現(xiàn)峰。如圖2左邊所示，樣品組(圖2-a)在10.473 min處出峰，與THC標準品(圖2-d)、CUR標準品(圖2-e)基本吻合，底物對照組與菌種對照組在該時間點均未出現(xiàn)峰?？梢猿醪酱_定該菌種能夠以CUR為底物生產(chǎn)DHC與THC。

A-樣品組在370 nm下HPLC圖；B-底物對照在370 nm下HPLC圖；C-菌種對照在370 nm下HPLC圖；D-DHC標準品HPLC圖；E-CUR標準品HPLC圖;a-樣品組在280 nm下HPLC圖；b-底物對照在280nm下HPLC圖；c-菌種對照在280 nm下HPLC圖；d-THC標準品HPLC圖；e-CUR標準品HPLC圖圖2 菌株ISO344轉化液液相圖譜

Fig.2 Liquid phase map of strain ISO344

2.4 菌種ISO344轉化液液質聯(lián)用分析結果

將菌種ISO344轉化液，進行UPLC-TOF-MS分析，進一步確定目標產(chǎn)物的相對分子量，根據(jù)離子色譜圖、負離子一級質譜圖以及一些特征的碎片離子進一步推斷轉化液中是否含有DHC與THC。質譜掃描范圍m/z0～700。如圖3-A所示轉化液在分子量370(DHC)處保留時間TR分別為4.69 min和5.75 min(具有酮式和烯醇式互變結構)，圖3-B所示轉化液在分子量372(THC)處保留時間TR分別為4.76 min和5.68 min (具有酮式與烯醇式結構)。

轉化液在4.69 min與5.75 min處的負離子吸收峰(一級質譜圖)如圖4-A和4-B所示，轉化液的負離子圖譜中主要有一個明顯的最高峰，在m/z369.1和370.01分別代表[M]-和[M+H]-的質譜信號峰,可以推測該物質為DHC。圖4-C、4-D分別是轉化液在4.76 min與5.68 min的負離子吸收峰(一級質譜圖)，其負離子圖譜中分別在m/z371.1和372.1分別代表[M]-和[M+H]-的質譜信號峰，可以推測該物質為THC。故可進一步確認該菌株ISO344可以姜黃素為底物轉化為DHC及THC。

A-轉化液在370分子量下的離子色譜圖；B-轉化液在372分子量下的離子色譜圖圖3 高效液相色譜-質譜聯(lián)用選擇離子色譜圖

Fig.3 High performance liquid chromatography-mass spectrometry combined ion chromatogram

A-轉化液在4.69 min處一級質譜圖；B-轉化液在5.75 min處一級質譜圖;C-轉化液在4.76 min處一級質譜圖；D-轉化液在5.68 min處一級質譜圖圖4 菌株ISO344轉化液的一級質譜圖

Fig.4 Primary mass spectrum of strain ISO344

2.5 真菌的初步鑒定

2.5.1 菌種形態(tài)特征

將菌株ISO344在YPD固體平板上培養(yǎng)3 d，觀察該菌種在平板上的菌落形態(tài)，其結果如圖5-A所示。

A-菌株ISO344平板菌落形態(tài)；B-菌株ISO344的顯微特征圖5 菌株ISO344形態(tài)特征

Fig.5 Morphological characteristics of strain ISO344

形狀：圓形；色澤:灰白；質地：干燥、粗糙、疏松；邊緣：鋸齒狀隆起；狀況：扁平。顯微鏡檢該菌種，觀察該菌種的形態(tài)，其結果如圖5-B所示。細胞呈圓形或橢圓形，緊密排列形成假菌絲。

2.5.2 菌種序列分析

挑取菌株ISO344的單菌落送上海生工生物科技有限公司進行基因測序，序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲序列號(基因庫登錄號為MH894770)。利用BLAST程序對所測菌種26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列進行同源性比對，并用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)進化樹。用鄰接法(neighbor-joining)進行發(fā)育樹分析。

由圖6可知，通過與模式菌株和試驗菌株基因序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與Cyberlindnerarhodanensisstrain DMKU-RK452相似性的高達100%，因此確定該菌株為Cyberlindnerarhodanensis。

圖6 基于26S rDNA Dl/D2區(qū)序列構建的菌株ISO344的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

Fig.6 Phylogenetic tree of ISO344 based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequence alignment

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.6.1 碳源對菌株轉化姜黃素的影響

以酵母菌的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，考察不同碳源以及不同濃度對產(chǎn)率的影響，如圖7所示。以葡萄糖為碳源時，DHC與THC的產(chǎn)率達到最大，分別為(9.85±0.12)%和(14.48±0.13)%，與其他碳源相比DHC和TCH產(chǎn)率存在顯著性差異(P<0.05)。因此選取40 g/L與20 g/L葡萄糖進行后續(xù)的試驗。

圖7 不同碳源(A)及碳源質量濃度(B)對DHC和THC的影響

Fig.7 Effects of different carbon sources(A) and carbon source concentrations(B) on DHC and THC

2.6.2 氮源對菌株轉化姜黃素的影響

DHC與THC產(chǎn)率隨著氮源種類及質量濃度的變化而變化。由圖8可知，在30 g/L蛋白胨時，DHC產(chǎn)率達到最大，為(15.48±0.22)%。

圖8 不同氮源(A)及氮源質量濃度(B)對DHC和THC的影響

Fig.8 Effects of different nitrogen sources(A) and nitrogen sources concentration(B) on DHC and THC

在20 g/L蛋白胨時，THC產(chǎn)率達到最大，為(20.52±0.13)%,與其他氮源相比，DHC和TCH產(chǎn)率存在極顯著性差異(P<0.01)。因此確定DHC與THC發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)氮源為蛋白胨，質量濃度分別為30 g/L和20 g/L。

2.6.3 無機鹽對菌株轉化姜黃素的影響

無機鹽是菌體細胞生長代謝不可或缺的成分，如圖9所示。在最優(yōu)的碳源與氮源基礎上，DHC在2 g/L K2HPO4產(chǎn)率達到最大，為(20.20±0.25)%。THC在3 g/L K2HPO4可達(24.31±0.12)%。K2HPO4不僅為菌體生長代謝提供鉀元素和磷元素，磷酸氫根還能在發(fā)酵液pH的緩沖和調(diào)節(jié)方面發(fā)揮一定的作用。因此選取2 g/L和3 g/L K2HPO4為發(fā)酵培養(yǎng)基最佳無機鹽。

圖9 不同無機鹽(A)及無機鹽質量濃度(B)對DHC和THC的影響

Fig.9 Effects of different inorganic salts(A) and inorganic salts concentration(B) on DHC and THC

3 結果與討論

本試驗采取以姜黃素為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基，篩選出83株菌種。通過HPLC初步確定有5株菌種能夠以姜黃素為底物，轉化生成DHC和THC。選擇初始產(chǎn)率最高的菌株ISO344作為目的菌種，進而通過液質聯(lián)用技術對轉化液進行分析，進一步推測是否含有DHC與THC。經(jīng)過形態(tài)學觀察和26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列比對分析，鑒定為Cyberlindnerarhodanensis。對基礎發(fā)酵培養(yǎng)基進行單因素試驗優(yōu)化，使DHC產(chǎn)率由10.49%提高至20.20%,THC產(chǎn)率由13.67%提高至24.31%。還需要多因素多水平的組合優(yōu)化實驗，得到更為準確的優(yōu)化培養(yǎng)基，此外還需分離提純DHC與THC做進一步鑒定。