王紹梅

基于外物提取的普洱茶抗氧化活性成分分析

王紹梅

滇西科技師范學(xué)院生物技術(shù)與工程學(xué)院, 臨滄 云南 677000

為了研究普洱茶在不同發(fā)酵過程中的化合物及其抗氧化活性成分，本文通過蒸餾萃取法對(duì)普洱茶進(jìn)行外物提取，隨后在提取物上分別采用GC-MS方法分析化合物組成成分，并采用DPPH和FRAP方法分析不同發(fā)酵過程中的普洱茶提取物的抗氧化活性。研究結(jié)果表明，普洱茶的外物提取溶液的抗氧化活性先上升后下降，總體出現(xiàn)顯著上升。外物提取的總體抗氧化活性出現(xiàn)顯著的提升。經(jīng)過發(fā)酵后的普洱茶中具有較多的揮發(fā)性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性和總體的抗氧化活性。單獨(dú)的1,2,3-三甲氧基苯對(duì)于DPPH自由基的清除能力較多，說明抗氧化活性一般由組合化合物完成，單獨(dú)化合物抗氧化性偏弱。

普洱茶; 提取物; 抗氧化性

普洱茶是一種以云南大葉類茶樹葉青毛茶為主要原料，經(jīng)過發(fā)酵之后產(chǎn)生了不同的化學(xué)變化，并產(chǎn)生了獨(dú)特的香氣[1-3]，由于其具有較強(qiáng)的保健功能，因此深受大多數(shù)人的喜愛[4]。與制作原料中的青毛茶相比，發(fā)酵后的普洱熟茶中的各種化學(xué)物質(zhì)都發(fā)生了變化，并在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了獨(dú)特香氣[4]。針對(duì)發(fā)酵后的普洱茶產(chǎn)生香氣的成分分析，已經(jīng)有研究表明是普洱茶提取物中的香氣主要來源于醇類和甲氧基苯化合物組成。由于普洱茶的外物提取方式是不密封的，因此在霉菌的作用下回產(chǎn)生大量的芳香類化合物，產(chǎn)生甲基化等氧化反應(yīng)[5]。其氧化反應(yīng)隨著時(shí)間周期呈現(xiàn)先增加后衰減的趨勢(shì)[6]；較強(qiáng)的抗氧化活性又能夠抑制存在于普洱茶中的脂類化合物發(fā)生氧化反應(yīng)造成不可逆的營養(yǎng)流失[7]。研究表明，通過不同溶劑在普洱茶中提取到的提取物在對(duì)DPPH自由基清除能力不同，其中的水提取物、乙醇沉淀物和乙酸乙酯提取物在對(duì)羥自由基的清除效果最好[8]。存在于普洱茶的乙酸乙酯和正丁醇化合物的組合物在實(shí)驗(yàn)研究中產(chǎn)生了強(qiáng)烈的DPPH和羥基等自由基的清除率，這說明了該組合化合物具有良好的抗氧化活性[9]。

與其他茶葉品種不同，普洱茶在外物提取上具有較大的差異[10]。因此，研究不同發(fā)酵階段的普洱茶的外物提取對(duì)于完善普洱茶在不同功效和抗氧化活性的規(guī)律上都具有重要的意義。因此，本文以不同發(fā)酵程度的普洱茶樣品作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過外物提取的方法分析不同發(fā)酵程度的普洱茶的化學(xué)成分，并在此基礎(chǔ)上通過DPPH和FRAP方法測(cè)定出普洱茶的抗氧化活性分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

下表1給出了普洱茶外物提取抗氧化活性分析的試劑情況。在本文中，選擇的化學(xué)試劑都是普洱茶的主流試劑[11]。

表 1 普洱茶外物提取抗氧化活性分析的試劑使用情況表

表2則給出了普洱茶外物提取抗氧化活性分析的儀器與設(shè)備使用情況。在儀器與設(shè)備使用中，可以是采用主流的普洱茶實(shí)驗(yàn)使用的儀器與設(shè)備[10]。

表 2 普洱茶外物提取抗氧化活性分析的儀器與設(shè)備使用情況表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱去普洱茶葉樣品100.0 g，為了完成對(duì)普洱茶的外物提取，使用50 mL二氯甲烷將茶葉樣品放入蒸餾萃取容器中對(duì)外物提取3 h，隨后采用無水硫酸鈉完成對(duì)提取物的干燥和過濾，獲取普洱茶樣品的無水乙醇容易，然后對(duì)無水乙醇溶液完成DPPH清除自由基的抗氧化活性測(cè)定[12]。

取出4.0 mL的普洱茶提取物進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，測(cè)定中采用1.0 mL無水乙醇和濃度為0.2 mmol·L-1的DPPH溶液1.0 mL，在陰涼處混合后靜置30 min觀察抗氧化活性。為了分析抗氧化活性的顯著性，采用相同的方式不加入普洱茶提取作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。此外，還需要測(cè)定1.0 mL待測(cè)溶液與3.0 mL無水乙醇溶液的吸光度作為空白對(duì)照組3。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，我們計(jì)算DPPH清除率，每個(gè)樣品同時(shí)測(cè)定3次并取平均值作為相應(yīng)的清除率，清除率的計(jì)算過程為：

(%)=[1-(1-3)/2]×100 (1)

其次，我們對(duì)普洱茶的外物提取進(jìn)行FRAP測(cè)定，測(cè)定其總體的抗氧化能力[13]。]在對(duì)普洱茶外物提取的樣品總抗氧化能力的測(cè)定中，準(zhǔn)備吸取樣品溶液200 μL，加入2.0 mL配置好的TPTZ工作溶液，在37 °C的水浴中反應(yīng)30 min，并測(cè)定在593 nm位置處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

在對(duì)普洱茶外物提取的抗氧化活性測(cè)定基礎(chǔ)之上，揮發(fā)性成分根據(jù) GC-MS 分析得到的各色譜峰，在假設(shè)檢驗(yàn)上采用SPSS平臺(tái)提供的樣本檢測(cè)，分析抗氧化活性的顯著性。

2.1 普洱茶外物提取的揮發(fā)性成分分析

表3給出了普洱茶主要化合物成分的抗氧化活性與外物提取成分含量的對(duì)比表，并且給出了DPPH和FRAP的相關(guān)系數(shù)分析。在表3中，A表示原料樣品，B表示一翻樣品，C表示二翻樣品，D表示三翻樣品，E表示四翻樣品，F(xiàn)表示五翻樣品，G表示出堆樣品，**表示0.01概率條件下的顯著性，*表示0.05概率條件下的顯著性。一般來說，普洱茶的原料香氣物質(zhì)來源于芳香族醇類、萜類、醛類等化合物，普洱茶在經(jīng)過渥堆反應(yīng)以后，蘊(yùn)藏在茶葉中的大量化合物都發(fā)生了一些化學(xué)變化，產(chǎn)生了具有較強(qiáng)抗氧化活性的甲氧基苯化合物，這些化合物共同提升了普洱茶在發(fā)酵過程中的抗氧化活性。與此同時(shí)，在普洱茶中產(chǎn)生香氣的萜類和醇類化合物則出現(xiàn)了微小的減少，呈現(xiàn)不太顯著的減小趨勢(shì)。

表 3 普洱茶不同發(fā)酵階段香氣含量及抗氧化活性相關(guān)系數(shù)

2.2 甲氧基苯的DPPH自由基清除能力分析

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，我們通過SPSS平臺(tái)提供的假設(shè)檢驗(yàn)工具計(jì)算DPPH自由基的清除能力。下圖1(a)給出了測(cè)定不同濃度的1,2,3-三甲氧基苯乙醇溶液DPPH自由基清除率。為了進(jìn)行橫向比較，我們將維生素C作為對(duì)比試驗(yàn)組，分析維生素C與不同濃度的1,2,3-三甲氧基苯乙醇溶液在DPPH自由基上的清除能力，從而反應(yīng)出了抗氧化活性的顯著性。現(xiàn)有研究結(jié)論指出[14]，普洱茶中的1,2,3-三甲氧基苯的含量范圍在[0, 20 mg·mL-1]之間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中采用的100.0 g的普洱茶樣品，且外物提取結(jié)果已經(jīng)通過乙醇溶解到40 mL，所以我們可以確定在進(jìn)行DPPH自由基清除計(jì)算之前普洱茶提取物中的1,2,3-三甲氧基苯的濃度在[0, 20 mg·mL-1]之間。因此，我們?cè)谠摑舛认逻M(jìn)行維生素C和1,2,3-三甲氧基苯乙醇溶液在DPPH自由基上的清除能力，圖中的結(jié)果表明了的半清除率遠(yuǎn)大于維生素C，而維生素C具有較強(qiáng)的抗氧化能力，因此普洱茶提取物中的1,2,3-三甲氧基苯乙醇溶液僅僅只有較弱的抗氧化活性能力。

圖 1 普洱茶外物提取溶液的DPPH自由基清除率和FRPA總體抗氧化值

2.3 基于FRPA方法的抗氧化能力分析

在實(shí)驗(yàn)中，我們基于FRPA方法分析普洱茶提取物的總體抗氧化性，通過FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)曲線完成對(duì)FPRA的總體抗氧化性分析：=7.7372-0.0189 (2=0.9998) (2)

根據(jù)FRPA的計(jì)算可以得出如圖1(b)中給出的FRPA的總體抗氧化值，圖中的橫坐標(biāo)表示的是不同翻的次數(shù)。對(duì)比結(jié)果表明了發(fā)酵程度越高，年限越久的普洱茶，在總體抗氧化活性上效果更好，隨著程度的提升具有明顯的上升的趨勢(shì)。總體抗氧化活性在第E列（第4翻的普洱茶）中達(dá)到了最高值(0.099 mmol·L-1)，隨后的抗氧化活性出現(xiàn)震蕩，與原始普洱茶樣品相比獲得了296%的提升，相應(yīng)的DPPH自由基的清除率變化趨勢(shì)則是保持了與抗氧化活性相同的變化趨勢(shì)。

2.4 普洱茶提取物的主要成分含量與抗氧化活性相關(guān)性分析

通過假設(shè)檢驗(yàn)檢驗(yàn)完成對(duì)普洱茶提取物的主要成分含量和抗氧化活性相關(guān)性分析（表1），從表3中可以看出，順勢(shì)芳樟醇、反式芳樟醇以及1,2-二甲氧基苯呈現(xiàn)出非常強(qiáng)烈的DPPH自由基清除效果，并且該三種主要化合物呈顯著的正相關(guān)性，經(jīng)過檢驗(yàn)分別為0.737(<0.05)，0.796 (<0.01)，0.917 (<0.01)。在總體抗氧化活性分析的FRPA分析結(jié)果中，該三種化合物中的甲氧基苯和芳樟醇等化合物之間顯示出了顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)結(jié)果分別是0.803 (<0.05), 0.641 (<0.05)，與其他的甲氧基苯類化合物和芳樟醇氧化都有不太顯著的正相關(guān)性。DPPH和FRAP的兩種方法的測(cè)定結(jié)果則顯示出了明顯的正相關(guān)性，相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)為0.923(<0.01)。

3 討論與結(jié)論

從文中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，普洱茶在不同發(fā)酵階段的普洱茶的外物提取溶液的抗氧化活性先上升后下降，總體出現(xiàn)顯著上升。外物提取的總體抗氧化活性出現(xiàn)顯著的提升[15]。經(jīng)過假設(shè)檢驗(yàn)分析相關(guān)系數(shù)發(fā)現(xiàn)，普洱茶提取物中的抗氧化活性來自于甲氧基苯和芳樟醇等化合物中，具有顯著的正相關(guān)性，該結(jié)果表明了普洱茶的抗氧化活性與甲氧基苯和芳樟醇氧化物的含量有關(guān)，增加這些化合物的不但能夠顯著的提升陳年普洱茶中的特殊香味的持久性，而且能夠提升普洱茶中各種化合物的抗氧化活性，避免化合物過早的發(fā)生氧化造成普洱茶香氣的變化。

實(shí)際上，由于茶葉中的化學(xué)成分較多，并且不同的化學(xué)成分具有不同的抗氧化活性，作為復(fù)雜的化合物綜合體，普洱茶的抗氧化能力是各個(gè)化合物綜合表達(dá)的結(jié)果[16]。在眾多的化學(xué)成分中，多酚類化合物是普洱茶中的重要抗氧化活性物質(zhì)之一。今后的研究方向包括通過更為細(xì)致的外物提取方法，從普洱茶中提取出各種單獨(dú)化合物并分析其抗氧化能力，然后通過各種不同的組合，分析不同化合物在抗氧化能力上的協(xié)同作用，進(jìn)一步挖掘普洱茶的抗氧化活性。

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The Analysis of Antioxidant Active Ingredients Extracted from Pu-Erh Tea by Foreign Objects

WANG Shao-mei

677000,

In order to research the chemical compound elements and the antioxidant activity of the Pu-Erh Tea under different fermentation procedures, this paper used the distillation extraction algorithm to extract foreign objects from the Pu-Erh Tea, and used the GC-MS algorithm, DPPH algorithm, and FRAP algorithm to analyze the chemical compound elements and the antioxidant activity of the Pu-Erh Tea under different fermentation procedures. Experimental results have shown that the antioxidant activity of the Pu-Erh Tea from the object extraction liquor have a first growing up then reducing antioxidant activity, and the totally antioxidant activity is rising. The totally antioxidant activity for the object extraction from Pu-Erh Teahave the significant improvements. By fermentation, the object extraction from Pu-Erh Tea has much more volatile matters, which have strong DPPH free radical scavenging activity and totally antioxidant activity. The single 1,2,3-trimethoxybenzene have a better ability to DPPH free radical scavenging, and such results have shown that the strong totally antioxidant is built from the combination of chemical compound elements, but the single chemical compound elements has a less antioxidant activity.

Pu-Erh Tea; extract; antioxidant activity

TS272.5;Q946.91

A

1000-2324(2019)02-0319-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.02.031

2018-03-06

2018-04-15

王紹梅(1967-),女,教授,高級(jí)評(píng)茶技師,高級(jí)茶藝技師. E-mail:lc_wangshaomei@163.com