程嘉怡，黃 和，2，曹湛慧，劉子聰

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)分析測(cè)試中心，廣東湛江 524088）

高良姜（Alpinia officinarum Hance） 屬姜科山姜屬多年生草本植物[1]，性辛、熱，具有溫胃止嘔、散寒止痛的功效[2]。近年來，高良姜已經(jīng)隨著高良姜綜合開發(fā)利用的不斷深入，除藥用外，高良姜已經(jīng)被應(yīng)用到食品領(lǐng)域中[2]。研究表明，高良姜中某些活性成分具有抗菌、抗氧化等作用，特別是黃酮類物質(zhì)表現(xiàn)出較好的抗菌活性[3]。因此，研究高良姜中黃酮類物質(zhì)的提取，對(duì)高良姜進(jìn)一步的開發(fā)利用及廣泛應(yīng)用有至關(guān)重要的作用。

試驗(yàn)采用索氏提取法、超聲波輔助提取2種方法，以黃酮類物質(zhì)提取率為指標(biāo)，對(duì)高良姜黃酮類物質(zhì)的提取進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取高良姜根莖，清洗干凈，用小刀將外層皮去掉。用刀切片，置于數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱中于50℃條件下烘干，再用高速粉碎機(jī)粉碎，過篩后于4℃冰箱保存，備用。

蘆丁，標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究所提供；甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、95%乙醇、丙酮、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-620S型電子天平，SHIMADZU公司產(chǎn)品；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；SIGMA3-18K型高速冷凍離心機(jī)，北京博勵(lì)行儀器有限公司產(chǎn)品；722S型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

高良姜→清洗→烘干（50℃，48 h） →粉碎→過篩（50目） →冰箱保存（4℃）。

1.3.2 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取50.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于250 mL容量瓶中，加入70%乙醇超聲溶解，定容至刻度，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液。

1.3.3 最佳測(cè)定波長(zhǎng)的確定

精密移取蘆丁對(duì)照品溶液、樣品溶液、空白各2.0 mL置于25 mL比色管中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻；加入70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置15 min[4]。于波長(zhǎng)200～600 nm處掃描，確定最大吸收峰波長(zhǎng)為505 nm。

1.3.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL分別置于25 mL比色管中，依次加入亞硝酸鈉溶液、硝酸鋁溶液、氫氧化鈉溶液和乙醇溶液，步驟同1.3.3，于波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，蘆丁對(duì)照品溶液在0.2～1.2 mg時(shí)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，所得回歸方程為Y=11.90X-0.005 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，具有良好的線性關(guān)系。

1.3.5 樣品的測(cè)定

樣品中黃酮類物質(zhì)含量的測(cè)定采用NaNO2-Al（NO3）3比色法。

精確吸取樣品溶液2.0 mL，置于25 mL比色管中，步驟同1.3.3，于波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度。利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中黃酮類物質(zhì)含量。

1.3.6 樣品中黃酮類物質(zhì)提取率的計(jì)算

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃酮的質(zhì)量濃度，通過下式計(jì)算提取率。

式中：C——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=11.90X-0.005 9）計(jì)算出的樣品中黃酮類物質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣品溶液體積，mL；

M——高良姜粉質(zhì)量，g。

1.3.7 樣品中黃酮的定性

硝酸鋁反應(yīng)：樣品提取液中加入2%硝酸鋁溶液，樣液顯色為黃色；鹽酸鎂粉反應(yīng)：樣品提取液中加入少量鎂粉，再加2滴鹽酸，樣液顯色為橙紅色；三氯化鐵反應(yīng)：樣品提取液中加入數(shù)滴1%三氯化鐵溶液，樣液顯色為灰綠色。通過黃酮類化合物的特征顏色反應(yīng)現(xiàn)象，確定提取物中含黃酮類化合物。

1.4 索氏提取法的工藝條件研究

1.4.1 單因素試驗(yàn)

以高良姜為原料，稱取3.00 g/份，以乙醇為提取劑，使用索氏提取器進(jìn)行提取。提取液紗布過濾，合并提取液，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min。將上清液合并，取一定體積稀釋。按1.3.5方法測(cè)定樣品中黃酮類物質(zhì)含量。

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響。試驗(yàn)考查乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%；固定提取溫度80℃，料液比1∶25，提取次數(shù)2次，提取時(shí)間1 h，考查不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響。平行試驗(yàn)3次，測(cè)定黃酮類物質(zhì)含量。

（2）料液比對(duì)提取效果的影響。試驗(yàn)考查料液比為 1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50；固定提取溫度80℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取2次，每次提取時(shí)間1 h，考查料液比的差異對(duì)提取效果的影響。平行試驗(yàn)3次，測(cè)定黃酮類物質(zhì)含量。

（3）提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。試驗(yàn)考查提取時(shí)間分別為1，2，3，4 h；固定提取溫度80℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶25?？疾樘崛r(shí)間差異對(duì)提取效果的影響。平行試驗(yàn)3次，測(cè)定黃酮類物質(zhì)含量。

（4）提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。試驗(yàn)考查提取次數(shù)分別為1，2，3，4，5次；固定提取溫度80℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶25，每次提取時(shí)間1 h，考查提取次數(shù)差異對(duì)提取效果的影響。平行試驗(yàn)3次，測(cè)定黃酮類物質(zhì)含量。

1.4.2 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，影響索氏提取法番石榴黃酮類物質(zhì)提取的因素有乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)，為此設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，以確定索氏提取法提取高良姜黃酮類物質(zhì)的最佳工藝。

1.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件，平行試驗(yàn)3次，以驗(yàn)證最佳工藝條件。

1.5 超聲波輔助提取法的工藝條件研究

1.5.1 單因素試驗(yàn)

以高良姜為原料，稱取3.00 g/份，以乙醇為提取劑，一定時(shí)間范圍內(nèi)超聲提取。紗布過濾提取液，濾液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min。將上清液合并，取一定體積稀釋。按1.3.5方法測(cè)定樣品中黃酮類物質(zhì)含量。

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇。試驗(yàn)考查乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%；固定料液比1∶20，超聲功率300 W，超聲時(shí)間30 min，考查乙醇體積分?jǐn)?shù)的差異對(duì)提取效果的影響。平行試驗(yàn)3次，測(cè)定黃酮類物質(zhì)含量。

（2）料液比的選擇。試驗(yàn)考查料液比分別為1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲功率300 W，超聲時(shí)間30 min，考查料液比的差異對(duì)提取效果的影響。平行試驗(yàn)3次，測(cè)定黃酮類物質(zhì)含量。

（3）超聲時(shí)間的選擇。試驗(yàn)考查超聲時(shí)間分別為 10，30，50，70，90 min；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶20，超聲功率300 W，考查超聲時(shí)間差異對(duì)提取效果的影響。平行試驗(yàn)3次，測(cè)定黃酮類物質(zhì)含量。

（4）超聲功率的選擇。試驗(yàn)考查超聲功率分別為300，350，400，450，500 W；固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶20，超聲時(shí)間30 min，考查超聲功率的差異對(duì)提取效果的影響。平行試驗(yàn)3次，測(cè)定黃酮類物質(zhì)含量。

1.5.2 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取影響超聲波輔助提取法提取番石榴黃酮類物質(zhì)的主要因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率，為此設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，以確定超聲波輔助提取法提取高良姜黃酮類物質(zhì)的最佳工藝。

1.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝，平行試驗(yàn)3次，以驗(yàn)證最佳工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 索氏提取法的工藝研究

2.1.1 單因素試驗(yàn)

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

由圖2可知，高良姜的黃酮類物質(zhì)提取率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～70%處于明顯的不斷上升狀態(tài)；而當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)70%時(shí)，提取率達(dá)到最大值；隨后提取劑體積分?jǐn)?shù)上升，提取率反而下降。乙醇溶液可以作為提取劑提取黃酮類物質(zhì)是因?yàn)橄嗨葡嗳艿脑?，而過高體積分?jǐn)?shù)的乙醇會(huì)促使某些醇溶性物質(zhì)析出，從而對(duì)黃酮的提取造成了影響[5]，因此選擇體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇進(jìn)行提取。

（2）料液比對(duì)提取率的影響。

料液比對(duì)提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響

由圖3可知，隨著高良姜和提取劑料液比的增大，高良姜黃酮類物質(zhì)的提取率一開始增長(zhǎng)比較迅猛。當(dāng)料液比大于1∶35后，提取率開始下降。在物料一定的情況下，提取劑的增加加大了其與原料相互接觸的面積，使得反應(yīng)更能充分進(jìn)行。而過大的料液比則由于在反應(yīng)已充分的情況下，沒有起到提高提取率的作用，同時(shí)造成了提取劑的浪費(fèi)，加大成本。因此，最佳的料液比選擇應(yīng)為1∶35。

（3）提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。

提取時(shí)間對(duì)提取率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間低于2 h時(shí)，由于在一定的時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)時(shí)間的增加有利于黃酮類物質(zhì)與有機(jī)溶劑反應(yīng)，提取率增加；當(dāng)提取時(shí)間高于2 h時(shí)，由于提取超過一定時(shí)間，其他化合物質(zhì)的溶出會(huì)影響黃酮類物質(zhì)提取率[3]，同時(shí)黃酮類物質(zhì)因暴露時(shí)間過長(zhǎng)而與空氣發(fā)生氧化[6]，大大降低提取效果，提取率顯著下降。因此，提取高良姜黃酮類物質(zhì)的最佳時(shí)間應(yīng)選擇為2 h。

（4）提取次數(shù)對(duì)提取率的影響。

提取次數(shù)對(duì)提取率的影響見圖5。

圖5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)增加，提取率先增大后緩慢下降，同時(shí)提取次數(shù)的增加會(huì)造成提取劑的用量加大。因此提取次數(shù)應(yīng)選為2次，提取率適宜的同時(shí)節(jié)約成本。

2.1.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，以黃酮類物質(zhì)提取率為考查指標(biāo)進(jìn)行L9（34）的正交試驗(yàn)。

索氏提取法正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，索氏提取法正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 索氏提取法正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 索氏提取法正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，對(duì)高良姜黃酮類物質(zhì)提取率影響因素的主次為A＞D＞B＞C，即料液比＞提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間。索氏提取法提取高良姜黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝為A1B3C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40，提取次數(shù)3次，每次提取時(shí)間2 h。

按照最優(yōu)組合條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40，提取次數(shù)3次，每次提取時(shí)間2 h進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次。試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，高良姜黃酮類物質(zhì)平均提取率達(dá)76.3 mg/g。

2.2 超聲波輔助提取法的工藝研究

2.2.1 單因素試驗(yàn)

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響見圖6。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

由圖6可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～60%時(shí)，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加；體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)提取率達(dá)最大值；隨后提取劑體積分?jǐn)?shù)上升，提取率急劇下降。與上述索氏提取法中提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響相似，高體積分?jǐn)?shù)的乙醇促使醇溶性物質(zhì)析出，因而對(duì)黃酮類物質(zhì)的提取造成了影響。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%溶液為宜。

（2）料液比對(duì)提取率的影響。

料液比對(duì)提取率的影響見圖7。

圖7 料液比對(duì)提取率的影響

由圖7可知，在1∶50～1∶30時(shí)，隨著高良姜與提取劑料液比的增大，提取率顯著增加；料液比大于1∶30后，提取效果開始明顯降低。與上述索氏提取法中料液比對(duì)提取率的影響相似，過大的料液比沒有起到提高提取率的作用。因此，最佳的料液比選擇應(yīng)為1∶30。

（3）超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響。

超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響見圖8。

由圖8可知，當(dāng)超聲時(shí)間少于50 min時(shí)，提取率隨時(shí)間遞增；超聲時(shí)間為50 min時(shí)提取率最大；多于50 min后提取率顯著降低。這可能是由于隨著時(shí)間的增加，溶液溫度升高使反應(yīng)溫度上升；而提取時(shí)間過長(zhǎng)產(chǎn)生過強(qiáng)的熱效應(yīng)會(huì)破壞提取物結(jié)構(gòu)，使提取率下降。因此，超聲時(shí)間50min對(duì)于試驗(yàn)的進(jìn)行是較合適的。

（4）超聲功率對(duì)提取率的影響。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

超聲功率對(duì)提取率的影響見圖9。

圖9 超聲功率對(duì)提取率的影響

由圖9可知，黃酮類物質(zhì)提取率隨超聲功率的增大而漸漸增大；當(dāng)超聲功率達(dá)450 W時(shí)提取率最大；超聲功率大于450 W后，提取率逐漸下降。這是因?yàn)槌暪β什蛔銜r(shí)，穿透能力稍弱、物料溫度低、分子運(yùn)動(dòng)慢，進(jìn)而影響物質(zhì)的提??；而超聲功率加大后其對(duì)物質(zhì)細(xì)胞壁的破壞程度增強(qiáng)，黃酮類物質(zhì)大量溶出[7]；而當(dāng)超聲功率超過一定限度時(shí)，高溫對(duì)黃酮類物質(zhì)氧化和破壞的作用加大[8]，同時(shí)部分果膠物質(zhì)溶出，從而影響測(cè)定結(jié)果，提取率降低。因此，提取高良姜黃酮類物質(zhì)的超聲功率應(yīng)選為450 W。

2.2.2 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率4個(gè)因素，以黃酮類物質(zhì)提取率為考查指標(biāo)進(jìn)行L9（34）的正交試驗(yàn)。

超聲波輔助提取法正交試驗(yàn)因素水平見表3，超聲波輔助提取法正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 超聲波輔助提取法正交試驗(yàn)因素水平

由表4可知，各因素水平對(duì)高良姜黃酮類物質(zhì)提取率的作用大小為 B'＞C'＞A'＞D'，即料液比 ＞ 超聲時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲功率。超聲波輔助提取法提取高良姜中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝為A'1B'3C'3D'1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶35，超聲時(shí)間70 min，超聲功率400 W。

按照最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次。試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，高良姜黃酮類物質(zhì)提取率達(dá)94.6 mg/g。

表4 超聲波輔助提取法正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 2種提取方法的比較

采用索氏提取法和超聲波輔助提取法在最佳工藝下提取高良姜黃酮類物質(zhì)，利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量，得到的提取率。

不同提取方法黃酮類物質(zhì)提取率的比較見表5。

表5 不同提取方法黃酮類物質(zhì)提取率的比較

由表5可知，采用超聲波輔助提取高良姜黃酮類物質(zhì)，所得到的提取率比索氏提取法高，而且所需的提取時(shí)間較短。因此，超聲波輔助法更適用于高良姜黃酮類物質(zhì)的提取。

2.4 黃酮類粗提物定性檢測(cè)

硝酸鋁反應(yīng)：將樣品提取液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%硝酸鋁溶液，樣品液顯示為黃色；鹽酸鎂粉反應(yīng)：將樣品提取液中加入少量鎂粉，再加2滴鹽酸，樣品液顯示為橙紅色；三氯化鐵反應(yīng)：將樣品提取液中加入數(shù)滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%三氯化鐵溶液，樣品液顯示為灰綠色。這都是黃酮類化合物的特征顏色反應(yīng)現(xiàn)象，最終確定樣品溶液中含黃酮類化合物。

2.5 黃酮類粗提物和純化物的質(zhì)量濃度計(jì)算

高良姜粉末經(jīng)過提取、濃縮，分離純化后得到粗提物和純化物。利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量，測(cè)得黃酮類粗提物和純化物的質(zhì)量濃度分別為0.624，0.861 mg/mL。

3 結(jié)論

分別采用索氏提取法和超聲波輔助法提取高良姜中黃酮類物質(zhì)。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以提取率作為指標(biāo)，索氏提取法最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40，提取次數(shù)3次，每次提取時(shí)間2 h，在此工藝條件下，高良姜黃酮類物質(zhì)提取率為76.3 mg/g。超聲波輔助法最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶35，超聲時(shí)間70 min，超聲功率400 W，超聲波輔助法提取的高良姜中黃酮類物質(zhì)提取率為94.6 mg/g。

通過對(duì)比，超聲波輔助法的提取率較高，而且其所需提取時(shí)間較短、成本較低，較適用于高良姜中黃酮類物質(zhì)黃酮物質(zhì)的提取。高良姜粉末經(jīng)過提取、濃縮，分離純化，得到粗提物和純化物。利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量，測(cè)得黃酮類粗提物和純化物的質(zhì)量濃度分別為0.624，0.861 mg/mL。