寇玉彬 陸運(yùn)松 陳小平

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院寶山分院 寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胰膽外科，上海 201999

紅景天是中國傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分為紅景天苷。大量研究證實紅景天苷具有廣泛的藥理作用，在抗缺氧、抗衰老、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等方面得到了公認(rèn)并廣泛應(yīng)用于臨床[1-4]。研究證實胰腺腫瘤微環(huán)境早期出現(xiàn)的低氧狀態(tài)(氧化應(yīng)激)能誘導(dǎo)活化胰腺腫瘤細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor, HIF)及下游活性因子過度表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)化重要的觸發(fā)因子之一[5]，進(jìn)而可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究根據(jù)胰腺癌微環(huán)境乏氧特性和紅景天的抗缺氧特性，觀察紅景天苷對胰腺癌BxPC-3細(xì)胞裸鼠移植瘤的作用。

材料與方法

一、動物與試劑

18只雌性裸鼠，清潔級，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供，動物使用許可證號SYXK(滬)2016-004。人源胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株購于上海潤成生物科技有限公司。紅景天苷購于上海源葉生物科技有限公司。Tunel試劑盒購于Roche公司。DAB濃縮型試劑盒購于上海長島生物技術(shù)有限公司。

二、裸鼠皮下移植瘤模型建立及分組

收集經(jīng)胰酶消化的對數(shù)生長期BxPC-3細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗滌1次后調(diào)整細(xì)胞密度為4×107/ml。消毒裸鼠后于腋下皮下接種100 μl BxPC-3細(xì)胞懸液，含4×106個細(xì)胞。待移植瘤生長到瘤長徑3～5 mm后，按數(shù)字表法將裸鼠隨機(jī)分為對照組、紅景天苷25 mg組和50 mg組，每組6只。對照組常規(guī)喂養(yǎng)，不給藥。紅景天苷25 mg組和50 mg組分別給予紅景天苷25 mg·kg-1·d-1和50 mg·kg-1·d-1，均分早晚兩次灌胃給藥。3周后處死裸鼠，取出移植瘤稱重、攝片，用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的最長徑及最短徑，根據(jù)公式V=ab2/2計算腫瘤體積，a為長徑，b為短徑。然后置-80℃冰箱保存。

三、移植瘤組織細(xì)胞凋亡檢測

胰腺癌移植瘤組織塊制作成0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，10%甲醛溶液固定48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用Tunel試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按說明書操作。在ECLIPSE Ni顯微鏡200倍視野下采集樣本相關(guān)部位拍照，DS-Ri2圖像分析系統(tǒng)計算胰腺癌細(xì)胞凋亡率。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、紅景天苷抑制移植瘤的生長

對照組、紅景天苷25 mg組和50 mg組移植瘤的重量分別為(1.561±0.416)、(0.742±0.272)、(0.276±0.064)g，體積分別為(2354.35±523.11)、(991.43±348.91)、(403.60±130.98)mm3，3組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01，圖1、2)，提示紅景天苷呈劑量依賴性抑制移植瘤的生長。

圖1 對照組(上)、紅景天苷25 mg組(中)和50 mg組(下)的移植瘤標(biāo)本

圖2 對照組、紅景天苷25 mg組和50 mg組移植瘤的生長曲線

二、紅景天苷誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡

對照組、紅景天苷25 mg組和50 mg組移植瘤的細(xì)胞凋亡率分別為(23.74±5.88)%、(49.30±6.75)%和(64.97±6.99)%，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)，提示紅景天苷呈劑量依賴性誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。

圖3 對照組(3A)、紅景天苷25 mg組(3B)和50 mg組(3C)移植瘤的細(xì)胞凋亡(Tunel染色 ×200)

討 論

紅景天的主要活性成分紅景天苷對心血管、肝臟、神經(jīng)等重要組織器官的缺氧有很好的保護(hù)作用[6]。研究證實紅景天苷能顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖[7]；能抑制人乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成[8]；具有較好抑制肺癌、宮頸惡性腫瘤細(xì)胞增殖的作用[9]。

胰腺癌是臨床常見的高度惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺腫瘤組織內(nèi)部呈低氧環(huán)境，當(dāng)惡性腫瘤生長接近2 mm時就需要新生血管來供血以增加供氧，而當(dāng)腫瘤接近1 cm3時缺氧明顯存在[10]。有學(xué)者研究紅景天苷對低氧條件下乳腺癌細(xì)胞生長的干預(yù)作用時發(fā)現(xiàn)，紅景天苷抑制腫瘤細(xì)胞增殖呈時間和劑量依賴，能顯著抑制低氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖[11]。因此，能否利用紅景天的抗缺氧作用來干預(yù)胰腺癌是本研究關(guān)注的重點。

本研究結(jié)果顯示，紅景天苷能顯著抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生長，且呈現(xiàn)出顯著的劑量相關(guān)性，與文獻(xiàn)報道相似[12]。進(jìn)一步的細(xì)胞凋亡染色結(jié)果表明，紅景天苷能顯著促進(jìn)人源胰腺癌BxPC-3細(xì)胞移植瘤的細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)與紅景天苷明顯的劑量依賴。有文獻(xiàn)證實，紅景天苷能抑制低氧誘導(dǎo)的HIF-1α和HIF-2α表達(dá)[13]，認(rèn)為紅景天苷可能用于HIF陽性的胰腺癌的治療，由此提示傳統(tǒng)中藥紅景天在胰腺癌的防治中可能大有作為，具體機(jī)制有待更加深入細(xì)致的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突