邱春燕 鄭楷煉 張火俊

1海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院放療科，上海 200433；2海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院普外科，上海 200433

胰腺癌具有高度侵襲性，發(fā)病率為4.2/10萬，約60%的患者確診時(shí)已遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率低, 中位生存時(shí)間僅為6～9個(gè)月[1-2]。雖然根治性手術(shù)是治愈胰腺癌的唯一機(jī)會(huì)，多項(xiàng)研究表明，化療和放療相結(jié)合可以最大限度地提高患者的生存率，并顯著緩解腹痛等臨床癥狀[3]。隨著細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4)及程序性死亡受體1及其配體(programmed death 1/programmed death-ligand 1, PD-1/PD-L1)免疫檢查點(diǎn)抑制劑如伊匹單抗、納武單抗、派姆單抗等在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌的治療研究中顯示出較好的效果[4-6]，具有潛在治療價(jià)值的免疫檢查點(diǎn)分子也被逐步開發(fā)，其中包括13個(gè)免疫共刺激分子[7-12]及10個(gè)免疫共抑制分子[13-16])，這些分子大多尚處于臨床試驗(yàn)階段[17]，因此對胰腺癌免疫微環(huán)境的全面分析以及分型可能為未來的免疫治療提供一定的生物學(xué)依據(jù)。enbabaoglu等[18]利用已發(fā)表的特征基因的表達(dá)水平來量化腫瘤內(nèi)24種免疫細(xì)胞類型的相對浸潤水平，并由MHC-I類基因(HLA-A/B/C、B2M)和參與抗原加工處理的基因(TAP1、TAP2和TAPBP)組成抗原呈遞體系(antigen presenting machinery, APM)評分，以及總體免疫浸潤評分(immune infiltration score, IIS，包括先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的浸潤評分)、T細(xì)胞浸潤評分(T cell infiltration score, TIS，包括CD8+T細(xì)胞、Th1、Th2、Th17、Treg、效應(yīng)性記憶T細(xì)胞、中樞性記憶T細(xì)胞、T輔助細(xì)胞和T細(xì)胞等9種T細(xì)胞的總體評分)。Yu和Wang[19]利用IIS、TIS和APM評分對肺腺癌、肺鱗癌轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平進(jìn)行聚類分析而實(shí)現(xiàn)對肺癌的免疫分型。本研究首次利用IIS、TIS和APM評分聚類分析胰腺癌免疫表型，以期為胰腺癌治療提供生物學(xué)依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料與分組

納入癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫中的177例原發(fā)性胰腺癌患者的臨床資料。llumina HiSeq 2000平臺保留的標(biāo)準(zhǔn)化3級RNA測序數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)從https://cancergenome.nih.gov獲得。使用版本3.3.2的R軟件(http://www.r-project.org)合并數(shù)據(jù)，利用edgeR包對RNA表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化以用于后續(xù)分析。

二、免疫細(xì)胞亞型浸潤分析

基于去卷積的原理，利用算法CIBERSORT對樣品中22種腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞亞群的相對純度進(jìn)行計(jì)算[21-22]。這22種腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞亞群包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、活化型肥大細(xì)胞、休眠型肥大細(xì)胞、活化型樹突狀細(xì)胞、休眠型樹突狀細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化型NK細(xì)胞、休眠型NK細(xì)胞、γδT淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Tregs)、輔助性濾泡T淋巴細(xì)胞、活化型CD4+記憶T淋巴細(xì)胞、休眠型CD4+記憶T淋巴細(xì)胞、幼稚型CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、記憶型B淋巴細(xì)胞、幼稚型B淋巴細(xì)胞。

三、免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)分析

統(tǒng)計(jì)TCGA數(shù)據(jù)庫兩組患者共刺激分子CD28、ICOSL、ICOS、CD40L、CD40、CD27L、CD27、4-1BBL、4-1BB、OX40L、OX40、GITRL、GITR及共抑制分子CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、VISTA、LAG-3、TIGIT、Galectin-9、 TIM-3、IDO-1 的log2轉(zhuǎn)化后表達(dá)水平，并進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)。

四、免疫功能的評價(jià)

運(yùn)用Rooney等[23]的方法，使用細(xì)胞殺傷活性(cytolytic activity, CYT)對腫瘤中免疫細(xì)胞的CYT進(jìn)行量化，CYT值為穿孔素1和顆粒酶A表達(dá)量的幾何平均值。利用12種趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL18、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13表達(dá)譜檢測腫瘤內(nèi)部的淋巴細(xì)胞聚集狀態(tài)，并作為免疫激活的標(biāo)志物。參考Strom等[24]的方法對12種趨化因子表達(dá)值進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，所得的PC1值作為抗腫瘤免疫激活水平的度量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者的臨床病理特征

TCGA數(shù)據(jù)庫的177例胰腺癌患者中男性97例(54.8%)，女性80例(45.2%)，白人、黑人、亞裔分別為156例(88.1%)、6例(3.4%)、11例(6.2%)，平均年齡(64±11)歲。57.0%患者有飲酒史，72.3%無慢性胰腺炎病史，61.0%無糖尿病史。78.0%患者的腫瘤位于胰頭部，82.5%為導(dǎo)管腺癌，59.3%切緣陰性，93.8%臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期，53.2%病理分級為G2級，腫瘤最大直徑為(3.86±1.65)cm，平均陽性淋巴結(jié)數(shù)為(2.91±3.32)個(gè)。76.3%采用Whipple術(shù)式，63.8%行術(shù)后化療，50.3%行靶向治療，18.1%行術(shù)后放療。

二、免疫成分高組及低組患者的免疫細(xì)胞亞型浸潤分析

無監(jiān)督聚類分析對177例樣本的IIS、TIS、APM評分的ssGSEA分析值顯示兩個(gè)主要簇，一個(gè)簇(86例)顯示出更高的IIS、TIS、APM評分，為免疫成分高組(immune high)，另一簇(91例)IIS、TIS、APM評分較低，為免疫成分低組(immune low，圖1A)。放療人群中免疫成分高組生存率略高于免疫成分低組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11，圖1 B)。

CIBERSORT評估22種免疫細(xì)胞的相對浸潤程度結(jié)果顯示，所有177例樣本中休眠型CD4+記憶T淋巴細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、幼稚型B淋巴細(xì)胞和休眠型肥大細(xì)胞的相對浸潤比例均最高(圖1C)。與免疫成分低組比較，免疫成分高組有明顯較多的中性粒細(xì)胞(63.4%比36.6%)、嗜酸性粒細(xì)胞(75.5%比24.5%)、活化型CD4+記憶T淋巴細(xì)胞(80.7%比19.3%)、幼稚型CD4+T淋巴細(xì)胞(81.2%比18.8%)以及幼稚型B淋巴細(xì)胞(59.5%比40.5%)；而免疫成分低組有明顯較多浸潤的活化型NK細(xì)胞(67.3%比32.7%)、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(68.9%比31.1%)、輔助性濾泡T淋巴細(xì)胞(67.7%比32.3%)以及活化型肥大細(xì)胞(62.9%比37.1%，圖1D)。其他免疫細(xì)胞亞型，包括休眠型肥大細(xì)胞、活化型樹突狀細(xì)胞、休眠型樹突狀細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、休眠型NK細(xì)胞、γδT淋巴細(xì)胞、休眠型CD4+記憶T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、記憶型B淋巴細(xì)胞在兩組的相對浸潤程度較為一致。

三、免疫成分高組與低組的免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)

與免疫成分高組比較，免疫成分低組的共刺激分子CD28、ICOS、CD40、CD40L、CD27、CD27L、4-1BB、OX40、GITR以及共抑制分子CTLA-4、PD-L2、PD-1、VISTA、LAG-3、TIGIT、Galectin-9、TIM-3、IDO-1顯著高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖2)。而共刺激分子ICOSL、4-1BBL、OX40L、GITRL以及共抑制分子PD-L1在兩組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、免疫成分高組與低組的免疫功能評價(jià)

免疫成分高組的12種趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL18、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13的PC1值顯著高于免疫成分低組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)；免疫成分高組的CYT值也顯著高于免疫成分低組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3)。

圖1 免疫細(xì)胞浸潤分析的IIS、TIS、APM評分的無監(jiān)督聚類分析(圖1A)；放療患者中免疫成分高組與低組患者的生存曲線及l(fā)og-rank檢驗(yàn)(圖1B)；22種免疫細(xì)胞相對浸潤程度的累積條形圖(圖1C)；免疫成分高組與低組的免疫細(xì)胞浸潤比較(圖1D)

圖2 免疫成分高組及低組的免疫檢查點(diǎn)共刺激分子(2A)和共抑制分子(2B)的表達(dá)

圖3 免疫成分高組及低組的免疫活性趨化因子PCA的PC1值(3A)和CYT(3B)

討 論

有研究闡明，活化型CD4+記憶T淋巴細(xì)胞[25]、活化型NK細(xì)胞[26]在抗腫瘤免疫中有正向調(diào)節(jié)作用，而調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞[27]、活化型肥大細(xì)胞[28]在抗腫瘤免疫中有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，推測這些不同功能的免疫細(xì)胞亞型浸潤程度的差異或多或少引起不同免疫表型的功能差異。事實(shí)上，前期研究已發(fā)現(xiàn)具有Th1表型和細(xì)胞毒性模式的記憶T細(xì)胞的強(qiáng)烈浸潤是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的最強(qiáng)預(yù)測因子，這一現(xiàn)象在腫瘤內(nèi)趨化因子能形成有效免疫反應(yīng)的結(jié)直腸癌中得到驗(yàn)證[29]。本研究納入的177例TCGA數(shù)據(jù)庫的胰腺癌樣本，按照IIS、TIS和APM評分的ssGSEA分析值進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析，主要區(qū)分出免疫成分高組和免疫成分低組兩簇。這兩組中的休眠型CD4+記憶T淋巴細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、幼稚型B淋巴細(xì)胞和休眠型肥大細(xì)胞的相對浸潤比例均最高。免疫成分高組的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、活化型CD4+記憶T淋巴細(xì)胞、幼稚型CD4+T淋巴細(xì)胞以及幼稚型B淋巴細(xì)胞的浸潤程度顯著高于免疫成分低組，而免疫成分低組的活化型NK細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、輔助性濾泡T淋巴細(xì)胞以及活化型肥大細(xì)胞的浸潤程度顯著高于免疫成分高組。其中的潛在關(guān)聯(lián)尚需更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究。

目前腫瘤樣本上的免疫組織化學(xué)檢測PD-L1表達(dá)水平仍是用于篩選可能對治療有反應(yīng)的患者最常用的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，大部分共刺激分子以及共抑制分子均在免疫成分低組顯著高表達(dá)，提示免疫檢查點(diǎn)阻斷劑治療可能對該組人群有效[30]。另外，這種共刺激與共抑制分子的協(xié)同表達(dá)驗(yàn)證了先前報(bào)道的多個(gè)免疫檢查點(diǎn)分子在T細(xì)胞上共表達(dá)的結(jié)果，為免疫檢查點(diǎn)抑制劑或激活劑組合策略的運(yùn)用提供一定生物學(xué)依據(jù)[31]。

Rooney等[23]首次對腫瘤中的免疫細(xì)胞CYT進(jìn)行量化，指出CYT值為穿孔素1和顆粒酶A表達(dá)量的幾何平均值。穿孔素1和顆粒酶A由細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞分泌的毒素并行使效應(yīng)功能，不同于諸如PD-L1等基于腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞的浸潤及表達(dá)標(biāo)記，因此CYT值是評價(jià)腫瘤浸潤免疫細(xì)胞功能的指標(biāo)。研究表明CYT在治療反應(yīng)和腫瘤進(jìn)展的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。在使用CTLA-4抗體治療的黑素瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤的CYT與腫瘤中的CD8+T細(xì)胞浸潤程度以及參與MHC I類抗原加工、呈遞途徑的基因表達(dá)密切相關(guān)[32]。

12種趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL18、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13基因是從一系列免疫、炎癥相關(guān)的基因中篩選而出[33]，與結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中腫瘤局部異位淋巴結(jié)的存在相關(guān)，并與患者的生存期改善有關(guān)[34]。本研究結(jié)果顯示，免疫成分高組的趨化因子表達(dá)水平PCA的PC1值以及CYT值均顯著高于免疫成分低組，反映了免疫成分高組具有更高的免疫激活水平及免疫細(xì)胞毒性。這個(gè)現(xiàn)象與免疫成分高組具有較高的總體IIS、TIS和APM評分一致，與前述大部分共刺激與共抑制分子在免疫成分低組協(xié)同高表達(dá)的結(jié)果相結(jié)合，說明共刺激與共抑制分子雖然協(xié)同表達(dá)，但共抑制分子在免疫調(diào)節(jié)中起到?jīng)Q定性作用[35]。

本研究結(jié)果還顯示，放療人群中的免疫成分高組患者的生存率略高于免疫成分低組，雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但反映了免疫成分高組可能與放療具有協(xié)同作用[36]。因此免疫成分高組人群中行放療可能使該人群獲益，但這一結(jié)果尚需要在更大樣本人群中進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突