覃明雄 ，陳洪濤 ，蔡丹昭 ，劉源煥 ，羅宇東 ，李芳嬋

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧 530023；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530022；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

惡性腫瘤的發(fā)病率逐年上升，已極大威脅人類健康［1］。中藥治療腫瘤具有多靶點、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，已經(jīng)成為抗腫瘤新藥研發(fā)的新方向［2］。復(fù)方白花蛇舌草膠囊是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院在篩選廣西壯瑤少數(shù)民族民間治療肝癌、肺癌驗方的基礎(chǔ)上，遵循中藥組方基本原則并結(jié)合壯瑤藥材的特點，選用白花蛇舌草、半枝蓮、白花丹、紫草、山豆根、蒲葵子、防己、白英、石上柏、小葉金花草、八月札等20味廣西特色藥材進(jìn)行組方，具有清熱解毒、止血鎮(zhèn)痛、消腫化瘀、益氣固本的功效，臨床上用于肝癌、肺癌的輔助治療效果良好。本課題組將該處方研制成膠囊，并對其進(jìn)行了抗腫瘤的藥效實驗研究，為復(fù)方白花蛇舌草膠囊進(jìn)入臨床實驗提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0003；SD大鼠，雄性，體重180～200 g，生產(chǎn)許可證：SCXK 桂 2014-0002；均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 試藥 復(fù)方白花蛇舌草膠囊干膏粉（由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供）。

1.3 細(xì)胞株及瘤株 BEL-7402株（人肝癌細(xì)胞）、HepG2株（人肝癌細(xì)胞）均購自武漢博士德生物工程有限公司；S180及H22肝癌腹水型種鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.4 儀器和試劑 CCK-8檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；DMEM全培養(yǎng)基（武漢博士德生物工程有限公司）；0.25%胰蛋白酶（武漢博士德生物工程有限公司）；吉姆薩工作液（Solarbio）；ALT、AST、TB 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；酶標(biāo)儀（美國Thermo，Multiskan Go 1510-00607c）；細(xì)胞成像儀（美國EVOS FL Auto）。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥動物血清的制備 取雄性SD大鼠39只，隨機(jī)分為4組：空白組3只，復(fù)方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑量組（劑量分別為14.84 g/kg、7.42 g/kg、3.71 g/kg）每組 12 只。給藥組按10 ml/kg體積灌胃給予相應(yīng)藥物，空白組予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。在末次給藥30 min、60 min、90 min、120 min，復(fù)方白花蛇舌草膠囊各劑量組分別取3只大鼠經(jīng)腹主動脈采血分離血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用前56℃、30 min滅活。

2.2 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對腫瘤細(xì)胞克隆的影響 取對數(shù)生長期的HepG2、BEL-7402細(xì)胞，消化計數(shù)，按103個/孔接種于6孔板中，設(shè)置空白對照組和含藥血清高、中、低劑量組（末次給藥后60 min），每組平行4孔含藥血清各劑量組作用24 h后更換培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 d，每日觀察，至出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞克隆時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，甲醇固定15min，吉姆薩染液染色40min，流水沖洗，晾干，于顯微鏡下觀察并計數(shù)大于50的細(xì)胞克隆數(shù)。見表1、表2及圖1、圖2。

表1 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細(xì)胞克隆的影響 （n=4，±s）

表1 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細(xì)胞克隆的影響 （n=4，±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.05

組 別 劑量（g/kg）克隆形成數(shù)空白對照組 — 92.51±10.30含藥血清高劑量組 14.84 64.33±12.16①含藥血清中劑量組 7.42 78.19±9.07含藥血清低劑量組 3.71 89.54±12.63

表2 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402 細(xì)胞克隆的影響 （n=4，±s）

表2 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402 細(xì)胞克隆的影響 （n=4，±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.05

組 別 劑量（g/kg）克隆形成數(shù)空白對照組 — 114.46±15.34含藥血清高劑量組 14.84 88.07±14.06①含藥血清中劑量組 7.42 95.37±11.48含藥血清低劑量組 3.71 107.16±13.55

圖1 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細(xì)胞克隆的影響

表1、表2結(jié)果顯示：與空白對照組比較，復(fù)方白花蛇舌草膠囊高劑量含藥血清作用于HepG2、BEL-7402細(xì)胞后，細(xì)胞的克隆數(shù)目明顯降低，有顯著性差異（P＜0.05），中、低劑量組細(xì)胞克隆數(shù)有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清可有效抑制HepG2、BEL-7402細(xì)胞的克隆形成。

圖2 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402細(xì)胞克隆的影響

2.3 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對腫瘤細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的HepG2、BEL-7402細(xì)胞，制成5×104個/ml單細(xì)胞懸液，按每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。實驗設(shè)立空白對照組及不同劑量含藥血清組，每個劑量平行4孔，空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基。加藥完畢后繼續(xù)孵育24 h，取出96孔板，每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm處測定各孔吸光度OD值。實驗重復(fù)3次，計算藥物對細(xì)胞的生長抑制率（IR）。抑制率=（1-實驗組OD值/空白對照組OD值）×100%。結(jié)果見表3、表4。

表3 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細(xì)胞增殖的影響 （n=4，±s）

表3 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2細(xì)胞增殖的影響 （n=4，±s）

OD值 IR OD值 IR OD值 IR OD值 IR空白對照組 — 0.67±0.11 — 0.67±0.11 — 0.67±0.11 — 0.67±0.11 —含藥血清高劑量組 14.84 0.81±0.15 -20.9 1.03±0.14 -53.7 0.61±0.10 9.0 0.86±0.07 -28.4含藥血清中劑量組 7.42 1.01±0.15 -50.7 0.53±0.07 20.9 0.56±0.11 16.4 0.77±0.06 -14.9含藥血清低劑量組 3.71 0.64±0.21 4.5 0.62±0.06 7.5 0.65±0.14 3.0 0.66±0.13 1.5組 別 劑量（g/kg）30 min 60 min 90 min 120 min

表4 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402細(xì)胞增殖的影響 （n=4，±s）

表4 復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對BEL-7402細(xì)胞增殖的影響 （n=4，±s）

OD值 IR OD值 IR OD值 IR OD值 IR空白對照組 — 0.89±0.16 — 0.89±0.16 — 0.89±0.16 — 0.89±0.16 —含藥血清高劑量組 14.84 0.82±0.11 7.9 0.72±0.11 19.1 0.76±0.14 14.6 0.82±0.15 7.9含藥血清中劑量組 7.42 0.90±0.08 -1.1 0.87±0.16 2.2 0.86±0.08 3.4 0.76±0.07 14.6含藥血清低劑量組 3.71 0.94±0.17 -5.6 0.91±0.13 -2.2 0.91±0.09 -2.2 0.93±0.18 -4.5組 別 劑量（g/kg）30 min 60 min 90 min 120 min

表3、表4結(jié)果顯示：與空白對照組比較，各劑量、各時間點的復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清處理細(xì)胞后OD值無明顯差異（P＞0.05），提示復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清對HepG2、BEL-7402細(xì)胞增殖無明顯抑制作用。

2.4 復(fù)方白花蛇舌草膠囊對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 取小鼠50只，隨機(jī)分成5組：空白對照組、香菇菌多糖片組（5 mg/kg）及復(fù)方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑量組（劑量分別為 21.2 g/kg、10.6 g/kg、5.3 g/kg），每組10只。各給藥組灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對照組灌服等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，每只小鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1 ml，0.5 h后脫臼頸椎處死動物，腹腔注射生理鹽水2 ml，輕揉腹部1 min，用碘伏消毒腹部，剪開皮膚，抽取腹腔沖洗液，分滴于2片載玻片上，每片0.2 ml。將載玻片放在墊有濕紗布的搪瓷盤中，置37℃溫箱中孵育30 min，取出載玻片，用生理鹽水漂洗除去未貼片的細(xì)胞，晾干，瑞特氏染液染色，顯微鏡下觀察，每片計數(shù)100個巨噬細(xì)胞，按下式計算吞噬率（%）和吞噬指數(shù)。吞噬率（%）=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100個巨噬細(xì)胞×100%；吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/100個巨噬細(xì)胞。結(jié)果見表5。

表5 復(fù)方白花蛇舌草膠囊對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 （±s）

表5 復(fù)方白花蛇舌草膠囊對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 （±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg）吞噬率（%）吞噬指數(shù)空白對照組 10 — 29.5±7.72 1.10±0.24香菇菌多糖片組 10 0.005 62.0±5.89① 1.62±0.37①復(fù)方白花蛇舌草膠囊高劑量組 10 21.2 51.0±4.16① 1.41±0.22①復(fù)方白花蛇舌草膠囊中劑量組 10 10.6 26.5±3.12 1.06±0.31復(fù)方白花蛇舌草膠囊低劑量組 10 5.3 26.0±5.65 1.17±0.28

表5結(jié)果顯示：與空白對照組比較，香菇菌多糖片組和復(fù)方白花蛇舌草膠囊高劑量組的吞噬率和吞噬指數(shù)明顯升高，有顯著性差異（P＜0.01）；而復(fù)方白花蛇舌草中、低劑量組吞噬率和吞噬指數(shù)無明顯變化。提示復(fù)方白花蛇舌草膠囊對巨噬細(xì)胞的吞噬功能有一定活化作用。

2.5 復(fù)方白花蛇舌草膠囊對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用 選取昆明種小鼠50只，隨機(jī)分成5組：H22荷瘤對照組、氟尿嘧啶組（0.02 g/kg）、復(fù)方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑量組（劑量分別為 21.2 g/kg、10.6 g/kg、5.3 g/kg），每組10只。無菌取腹腔內(nèi)傳代7 d的H22肉瘤細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個/ml，按每只0.2 ml接種于各組小鼠右腋皮下。接種24 h后，各用藥組按20 ml/kg灌胃體積給予相應(yīng)藥物，H22荷瘤對照組給予蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后3 h，處死小鼠，剝離完整腫瘤組織，電子天平稱量瘤體濕重。與H22荷瘤對照組比較，計算平均瘤重和抑瘤率，結(jié)果見表6。

表6 各組對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用比較 （±s）

表6 各組對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用比較 （±s）

注：與 H22荷瘤對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg）平均瘤重（g）抑瘤率（%）H22荷瘤對照組 10 — 0.57±0.19 —氟尿嘧啶組 10 0.02 0.21±0.13② 63.16復(fù)方白花蛇舌草膠囊高劑量組 10 21.2 0.40±0.11① 29.82復(fù)方白花蛇舌草膠囊中劑量組 10 10.6 0.36±0.12① 36.84復(fù)方白花蛇舌草膠囊低劑量組 10 5.3 0.49±0.20 14.03

表6結(jié)果顯示：與H22荷瘤對照組比較，氟尿嘧啶組及復(fù)方白花蛇舌草膠囊高、中劑量組的平均瘤重明顯降低，有顯著性差異（P＜0.05或 P＜0.01）；復(fù)方白花蛇舌草膠囊低劑量組平均瘤重有降低的趨勢，但差異無顯著性意義（P＞0.05）。提示復(fù)方白花蛇舌草膠囊對H22荷瘤小鼠的腫瘤生長有一定的抑制作用。

2.6 復(fù)方白花蛇舌草膠囊對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用 選取昆明種小鼠50只，隨機(jī)分成5組：S180荷瘤對照組、氟尿嘧啶組（0.02 g/kg）、復(fù)方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑量組（劑量分別為 21.2 g/kg、10.6 g/kg、5.3 g/kg），每組10只。無菌取腹腔內(nèi)傳代7 d的S180肉瘤細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個/ml，按每只0.2 ml接種于各組小鼠右腋皮下。接種24 h后，各用藥組按20 ml/kg灌胃體積給予相應(yīng)藥物，S180荷瘤對照組給予蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后3 h，處死小鼠，剝離完整腫瘤組織，電子天平稱量瘤體濕重，與S180荷瘤對照組比較，計算平均瘤重和抑瘤率，結(jié)果見表7。

表7 各組對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用比較 （±s）

表7 各組對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用比較 （±s）

注：與S180荷瘤對照組比較，①P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg）平均瘤重（g）抑瘤率（%）S180荷瘤對照組 10 — 2.26±0.97 —氟尿嘧啶組 10 0.02 1.08±0.65① 52.21復(fù)方白花蛇舌草膠囊高劑量組 10 21.2 1.96±0.93 13.27復(fù)方白花蛇舌草膠囊中劑量組 10 10.6 2.17±0.81 3.98復(fù)方白花蛇舌草膠囊低劑量組 10 5.3 1.93±0.88 14.60

表7結(jié)果顯示：與S180荷瘤對照組比較，氟尿嘧啶組平均瘤重明顯降低，有顯著性差異（P＜0.01）；復(fù)方白花蛇舌草膠囊高、中、低劑組平均瘤重有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示復(fù)方白花蛇舌草膠囊對S180荷瘤小鼠的腫瘤生長未能表現(xiàn)出有效抑制。

3 討 論

復(fù)方白花蛇舌草膠囊選用白花蛇舌草、半枝蓮為君藥，白花蛇舌草具有清熱解毒功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實其對人肝癌、肺癌、結(jié)腸癌等癌細(xì)胞均具有抑制或誘導(dǎo)凋亡作用［3-5］；半枝蓮可清熱解毒、化瘀利尿，其提取物可抑制肺癌MCF7細(xì)胞增殖［6］，所含的槲皮素能抑制前列腺癌細(xì)胞的生存和繁殖［7］；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，半枝蓮的活性成分對前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌有顯著作用［8］。二藥聯(lián)用，增強(qiáng)了處方藥物的抗腫瘤能力。

由于中藥口服后其成分常在胃腸道內(nèi)受到消化液和腸道微生物作用，其有效成分并不一定與體內(nèi)直接發(fā)揮作用的成分相符，而用含藥血清進(jìn)行藥理實驗更能反應(yīng)中藥的藥理作用與有效成分的關(guān)系［9］。因此我們制備了復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清，觀察其在體外對腫瘤細(xì)胞的作用。

腫瘤細(xì)胞具有永生性，因此可以由一個祖先細(xì)胞增殖形成克隆，而分化成熟的細(xì)胞則不能形成。將處理后的腫瘤單細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每個有腫瘤特性的細(xì)胞就能形成克隆，因此克隆形成數(shù)反映了腫瘤細(xì)胞生存增殖能力［10］。復(fù)方白花蛇舌草膠囊含藥血清能有效抑制HepG2、BEL-7402細(xì)胞的克隆形成，說明復(fù)方白花蛇舌草膠囊對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞具有抑制克隆形成的能力，但對相應(yīng)癌細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯。

巨噬細(xì)胞既可作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞也能作為效應(yīng)細(xì)胞去破壞、清除靶細(xì)胞，還可以識別腫瘤細(xì)胞并對其進(jìn)行非特異性的免疫應(yīng)答［11］。復(fù)方白花蛇舌草膠囊高劑量組對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能有顯著活化作用，其抗腫瘤作用可能與這一免疫調(diào)節(jié)功效有關(guān)。

本實驗建立了H22荷瘤小鼠和S180荷瘤小鼠兩個模型，觀察復(fù)方白花蛇舌草膠囊體內(nèi)抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，復(fù)方白花蛇舌草膠囊高、中劑量組的平均瘤重明顯低于H22荷瘤對照組，其中中劑量組對H22荷瘤小鼠抑瘤率達(dá)36.84%，說明復(fù)方白花蛇舌草膠囊不但對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞有一定的抗腫瘤作用，也能在體內(nèi)抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長。

由于中藥制劑較少單用于抗腫瘤臨床治療，復(fù)方白花蛇舌草膠囊原處方在臨床上也是用于放化療后的輔助治療。有研究報道，中藥組方在荷瘤小鼠化療過程中可發(fā)揮減毒增效作用［12-14］，因此，本課題組將進(jìn)一步開展復(fù)方白花蛇舌草膠囊與放化療藥物聯(lián)用的抗腫瘤作用研究，以為臨床實踐提供科學(xué)依據(jù)。