周 刊，呂冬寧，陶志虎

（1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530022）

腎小管壞死的主要原因是腎缺血再灌注損傷（ischemic reperfusion，IR），并由此導致臨床急性腎損傷（AKI），在腎缺血再灌注損傷時腎小管上皮細胞凋亡過程的作用非常關(guān)鍵。細胞凋亡的影響因素非常多，其中Bcl-2家族基因是非常關(guān)鍵性的影響因素，能在很大程度調(diào)控腎IR損傷細胞凋亡。專家提出中藥黃芪能夠在一定程度上保護腎IR損傷，但其作用機制尚未明確［1-2］。本研究擬分析黃芪水煎劑（AE）對急性IR損傷大鼠腎小管細胞凋亡與Bcl-2、Bax表達的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及用材 ①實驗動物：從廣西醫(yī)科大學實驗動物中心購進雄性健康SD大鼠［合格證號：SCXK（桂）2005-0001］30 只，體質(zhì)量 200～220 g，大鼠喂養(yǎng)地點是廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心。②藥物：黃芪生藥水煎劑（濃度：0.2 g/ml）。③試劑：原位細胞凋亡（TUNEL）檢測試劑盒（廣西博士德生物工程有限公司）；DAB顯色試劑盒及Trizol試劑（USA Invitrogen公司）；HRP標記的二抗、兔抗大鼠Bcl-2、兔抗β-actin、Bax單克隆抗體（USA Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 30只大鼠按照隨機數(shù)字表法分成假手術(shù)組、缺血再灌注損傷（IR）組和AE預處理組。

1.2.2 給藥 在手術(shù)前3 d，AE預處理組給予黃芪水煎劑，經(jīng)腹腔注射給藥（0.2 g/ml/kg），每天1次，共3 d。假手術(shù)組與IR組經(jīng)腹腔注射給予等量生理鹽水。三組在最后一次給藥（或生理鹽水）后4 h予手術(shù)造模［3］。

1.2.3 造模與取材 三組選用麻醉注射劑為戊巴比妥鈉（45 mg/kg），經(jīng)腹腔注入，在腹正中部位制造創(chuàng)面，將雙側(cè)腎臟充分暴露，IR組、AE預處理組使用無損動脈夾將雙側(cè)腎動脈夾緊，維持45 min后松開無損傷動脈夾，恢復灌注狀態(tài)，能夠觀察到腎臟顏色從暗紅轉(zhuǎn)至鮮紅，提示灌注順利，之后縫合切口［4］。假手術(shù)組只將雙側(cè)腎臟處于游離狀態(tài)，并且進行1 h的暴露，再將腹腔切口縫合。三組手術(shù)結(jié)束6 h后進行第2次麻醉操作，將左腎摘除，予4%甲醛固定部分腎組織，固定維持1 d后用酒精按一定濃度梯度順序脫水、石蠟包埋；另外剩余腎組織即時存儲在液氮內(nèi)，凍透之后存儲條件為-80℃，以備RNA及蛋白質(zhì)的提取檢測［5］。

1.2.4 檢測指標 ①腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9活性：采用熒光試劑盒檢測。②腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)：腎小管細胞凋亡率（%）為腎小管上皮凋亡陽性細胞數(shù)在腎小管總細胞數(shù)中的所占比例［6］。③腎組織Bax、Bcl-2表達：采用實時定量PCR法檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料以“±s”表示，采用 t檢驗，以P＜0.05表示差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況比較 假手術(shù)組大鼠腎組織中極少見到凋亡細胞，細胞凋亡率為（2.91±0.41）%；IR 組腎小管上皮細胞凋亡率為（39.52±6.33）%，明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），凋亡細胞主要集中在皮髓質(zhì)交界和髓質(zhì)；AE預處理組腎組織細胞凋亡率為（19.47±5.75）%，顯著低于IR組（P＜0.05）。

2.2 三組大鼠腎組織Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和Fas表達情況比較 見表1、圖1。

2.3 三組大鼠腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9表達情況比較 見表2、圖2。

表1 三組大鼠腎組織Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和Fas表達值比較 （±s）

表1 三組大鼠腎組織Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和Fas表達值比較 （±s）

注：與假手術(shù)組相比，①P＜0.05；與 IR 組相比，②P＜0.05，下表同

組 別 n Bax（g/kg）Bcl-2（g/kg）Bax/Bcl-2 Fas（g/kg）假手術(shù)組 10 0.24±0.05 0.39±0.05 0.62±0.09 0.40±0.08 IR 組 10 0.71±0.29① 0.51±0.13① 1.35±0.19① 0.25±0.26①AE預處理組 10 0.51±0.14② 0.65±0.16② 0.81±0.15② 0.12±0.09②

圖1 三組大鼠腎組織Bax、Bcl-2和Fas的表達情況

3 討論

在手術(shù)過程中常常會出現(xiàn)腎IR損傷的癥狀，極有可能會誘發(fā)急性腎損傷（AKI），甚至會使得患者喪失腎功能，其中損傷最快的是腎小管上皮細胞，臨床上相關(guān)研究提出腎IR損傷的關(guān)鍵性途徑就是腎小管上皮細胞凋亡，所以，研究出抑制腎小管細胞凋亡的方法對AKI的預防來說具備臨床價值［7-8］。AE可以憑借對IR大鼠Bax/Bcl-2基因表達的調(diào)節(jié)，對IR損傷大鼠腎小管細胞凋亡的整個過程形成制約作用，進而使得腎缺血再灌注損傷得到糾正。

表2 三組大鼠腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9 表達情況比較 （±s）

表2 三組大鼠腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9 表達情況比較 （±s）

組 別 n caspase-3（μM）caspase-8（μM）caspase-9（μM）假手術(shù)組 10 0.39±0.07 0.33±0.05 0.43±0.08 IR 組 10 0.77±0.14① 0.93±0.15① 0.90±0.13①AE 預處理組 10 0.59±0.08② 0.61±0.08② 0.63±0.11②

圖2 三組大鼠腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白質(zhì)表達情況

本研究數(shù)據(jù)顯示腎缺血再灌注操作進行之后會顯著增加腎小管細胞凋亡的總數(shù)，這與既往研究相符。細胞凋亡包括：線粒體途徑，其中調(diào)控基因主要是抗凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax，兩種基因?qū)嶋H比例會對細胞凋亡現(xiàn)象的形成產(chǎn)生較大影響［9］；死亡受體途徑，死亡受體例如Fa-L和Fas結(jié)合之后，就會使得下游分子活化，進而啟動細胞凋亡。上述兩種方式都會使得Caspase活化，加速細胞凋亡。缺血性損傷之后細胞死亡的關(guān)鍵性模式就是凋亡，細胞凋亡的調(diào)控影響因素包括多種有關(guān)基因與對應的蛋白，基因主要包括抗凋亡基因與促凋亡基因［10］。近些年的報道中提出，Bcl-2與Bax是一種調(diào)控分子，嚴重影響腎缺血再灌注過程中細胞的存在狀態(tài)，Bcl-2的影響程度最大，Bcl-2表達程度過高或Bcl-2/Bax比例提高都會使得Bax的表達受到制約，進而使得細胞凋亡過程被抑制，這種抑制的機理主要有以下幾種可能：（1）對pr-ICE到ICE的轉(zhuǎn)化過程形成制約，對促細胞凋亡基因信號的傳達產(chǎn)生阻隔作用，或是使得相關(guān)基因失效［11］；（2）細胞器Ca2+內(nèi)流出現(xiàn)變化，進而使得凋亡過程受到阻礙；（3）對氧自由基產(chǎn)生制約，體現(xiàn)為抗細胞凋亡效應；（4）和raf-1結(jié)合，促進細胞增殖，對凋亡產(chǎn)生抑制作用。增強Bax表達之后，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔將處于開放狀態(tài)，進而使得胞質(zhì)內(nèi)引入大量的細胞色素C，促進凋亡［12］。簡而言之，Bax表達強化，會促進凋亡；Bcl-2表達強化，能制約凋亡，Bax/Bcl-2表達的平衡狀態(tài)會在很大程度上影響細胞存在狀態(tài)，其比值提高會促進凋亡，比值減小會抑制凋亡［13］。根據(jù)本研究結(jié)果得知，IR環(huán)節(jié)中細胞凋亡指數(shù)能夠因為AE預處理的進行而減小，進而使得Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達分別得到抑制、強化，Bax/Bcl-2比例也會因此減小，并且表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性，這就表明黃芪可以對凋亡相關(guān)基因進行調(diào)節(jié)，使得Bax/Bcl-2比例出現(xiàn)改變，并因此讓比例趨近于1，對caspase3的表達產(chǎn)生抑制作用，進而避免出現(xiàn)腎小管細胞凋亡的現(xiàn)象，降低缺血性ARF的發(fā)生率［14］。

黃芪具有斂瘡生肌、補氣固表、排膿、利尿托毒的功效，常作為補益藥運用于臨床治療中，適用于血虛、瘀、氣虛等證候。腎缺血再灌注損傷表現(xiàn)為典型的氣血虛弱、瘀血阻滯證候，運用黃芪有利于改善腎組織再灌注后損傷、降低鈉排泄分數(shù)提高程度，對IR大鼠腎小管細胞凋亡產(chǎn)生顯著抑制作用，其作用機理可能與其對Bcl-2、Bax表達的調(diào)節(jié)有較大關(guān)系［15］。同時，細胞凋亡的調(diào)節(jié)與其他復雜的機理也存在關(guān)系，黃芪水煎劑對腎小管細胞凋亡的制約效應和抗氧化效果的機理有待今后進一步研究，進而為臨床運用黃芪進行缺血性AKI的防治提供可靠的實驗依據(jù)。