楊 靜 阿古拉

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100

五味沙棘方是蒙藏醫(yī)臨床常用的傳統(tǒng)方藥之一，全方由沙棘膏、木香、白葡萄干、甘草、梔子5味藥組成, 沙棘膏為方中君藥,含多種黃酮化合物,主要有異鼠李素、異鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-β-D-蕓香糖苷、槲皮素、山奈素。方中以味酸,性溫,銳而有止咳、祛痰、除巴達(dá)干功效的沙棘膏為主;以排膿、祛痰的木香為輔,配以白葡萄干以清肺熱、止咳、平喘,甘草以清熱,止咳、祛痰,梔子以清血熱為之佐使。功能主治清熱祛痰、止咳定喘,臨床用于肺熱久咳、喘促痰多、胸中滿悶等?，F(xiàn)行2015年版《中國藥典》一部收載有五味沙棘散,且其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為完善[1]，市場上已有五味沙棘顆粒、五味沙棘含片及五味沙棘口服液等，但有關(guān)泡騰片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究尚未見報(bào)道。鑒于此將其制成迅速溶解，吸收迅速，便于患者服用的口服泡騰片劑型。蒙藏醫(yī)臨床常用的傳統(tǒng)方藥，采用水平正交試驗(yàn)法，以方中君藥沙棘膏中槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量作為提取工藝的評價(jià)指標(biāo)，來優(yōu)化提取工藝。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀(SPD-M20A二極管陣列檢測器、CBM-20A型控制器、CTO-20A柱溫箱、LC-20AT型輸液泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、LC solution色譜數(shù)據(jù)工作站、DGU-20A5型脫氣機(jī))，電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)，HH-D4型數(shù)控恒溫水浴鍋(金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠)，甲醇、磷酸(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司)、乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，色譜甲醇(SIGMA-ALDRICH),水為超純水，槲皮素、山柰素、異鼠李素(中國食品藥品檢定研究院)，中藥材(內(nèi)蒙古天力藥業(yè)有限公司)

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝條件 由于處方中多數(shù)藥材的已知有效成分在乙醇中具有較好的溶解性[2-6]。故采用單因素考察后，選用L9(34)水平正交試驗(yàn)，以槲皮素、山柰素和異鼠李素含量對工藝進(jìn)行優(yōu)化，所確定的正交因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.2 槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量測定

2.2.1 色譜條件 采用Agilent C18色譜柱(250mm×4.6mm),5 μm;流動(dòng)相為甲醇：0.4%磷酸水溶液(65∶35)，流速1 mL·min-1，柱溫35℃，檢測波長370 nm，進(jìn)樣10 μL。

2.2.2 供試品溶液 取五味沙棘方中除木香外的其余四味藥,精密稱定, 置圓底燒瓶中, 精密加入8倍量的75%乙醇, 加熱回流l h,提取2次, 濾過放冷, 用旋轉(zhuǎn)蒸餾儀回收乙醇后將藥液定容于100 mL容量瓶中備用。精密量取25 mL，置具塞錐形瓶中, 加鹽酸3.5 mL， 加熱回流水解1 h, 立即冷卻, 移至50 mL量瓶中, 用適量75%乙醇洗滌容器,洗液并入同一量瓶中,加75%乙醇至刻度,搖勻,濾過,即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素3.559 mg、山柰素2.534 mg、異鼠李素3.021 mg分別置于100 mL、100 mL、10 mL容量瓶中用甲醇溶解并定容，搖勻，濾過，即得對照品溶液

2.2.4 陰性對照試驗(yàn) 陰性對照提取液(處方中缺沙棘膏藥材),按提取物測定液的制備方法制備供試液,進(jìn)樣測定。結(jié)果表明其色譜在槲皮素、山柰素、異鼠李素相應(yīng)保留時(shí)間無峰，如圖1所示。說明處方中其他成分對測定結(jié)果無干擾。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.3”節(jié)下混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”節(jié)下色譜條件進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量對峰面積積分值進(jìn)行回歸分析，所得結(jié)果見表2，3種黃酮在所測定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 3種黃酮線性關(guān)系

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL進(jìn)樣,按2.2.1項(xiàng)下重復(fù)進(jìn)樣6次,測得槲皮素、山柰素和異鼠李素的峰面積積分值,計(jì)算RSD分別為0.65%、0.74%、0.86%。表明方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取提取液測定液，按0、2、4、6、8 h不同時(shí)間間隔進(jìn)樣，測得槲皮素、山柰素和異鼠李素的峰面積積分值，計(jì)算RSD分別為1.03%、1.15%、1.52%，結(jié)果表明提取物測定液中槲皮素、山柰素和異鼠李素在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取樣品5份，按供試品溶液制備方法平行制備5份溶液，進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣2次，計(jì)算槲皮素、山柰素、異鼠李素含量的RSD分別為0.77%、0.57%、0.77%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已測知含量的五味沙棘提取物的樣品,分別加入不同質(zhì)量的槲皮素(見表3)山柰素(見表4)異鼠李素(見表5)對照品,按樣品溶液的制備方法制備樣品,測定其含量,計(jì)算回收率。

表3 槲皮素對照品

表4 山柰素對照品

表5 異鼠李素對照品

2.10 提取物含量測定 精密吸取正交試驗(yàn)各試驗(yàn)號(hào)提取液測定液10 μL,按上述色譜條件依次進(jìn)樣,測定槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積積分值如圖1所示；經(jīng)計(jì)算槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量見表6。

2.3 試驗(yàn)結(jié)果分析 采用綜合平衡法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析(SPSS統(tǒng)計(jì)軟件),結(jié)果見表6、表7。由表6中的R值可知，以槲皮素、山柰素、異鼠李素的總含量為指標(biāo)時(shí)，影響因素的大小順序均為A>C>D>B。說明溶劑濃度和提取時(shí)間是重要因素，提取次數(shù)和溶劑倍數(shù)次之。由方差分析結(jié)果可知，因素A、C對總含量的影響均有顯著性。結(jié)合極差分析，并按生產(chǎn)實(shí)際中降低消耗，提高效率的原則，確定五味沙棘泡騰片較優(yōu)的提取工藝條件為A2B3C1D2，即加入75%乙醇8倍量，提取2次，每次1 h。

表7 主旨間效果檢定 因變數(shù): VAR00001

注：a.R2=0 .870(調(diào)整的R2=0.755)。

2.4 提取工藝的驗(yàn)證 按上述較優(yōu)的工藝進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證(n=6)，結(jié)合槲皮素、山柰素、異鼠李素總含量的平均值為3.6300 mg/g，表明所確定的較優(yōu)工藝合理可行。

3 討論

考慮到槲皮素、山柰素、異鼠李素的化學(xué)性質(zhì)，在進(jìn)行提取工藝條件的考察時(shí)，采用了65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇 、95%乙醇作為溶媒進(jìn)行回流提取。結(jié)果表明，75%乙醇較優(yōu)，考慮到濃度為影響因素，故以70%、75%、80%為提取溶劑濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)考察。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道沙棘膏中黃酮類化合物大多數(shù)以糖苷的形式存在，主要以槲皮素苷、山柰素苷、異鼠李素苷。如果直接測槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量發(fā)現(xiàn)及其低，難以反映黃酮類化合物的真實(shí)含量，因此試驗(yàn)中采取酸水解后測定槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量。為了盡可能短時(shí)間內(nèi)獲得較好的分離效果，對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了不同組成的流動(dòng)相，如乙腈—水、甲醇—水、甲醇—酸系統(tǒng)，酸比較了磷酸和冰醋酸。結(jié)果表明磷酸可以減少色譜峰拖尾，使色譜峰達(dá)到較高的對稱性，改善了分離度，最終確定下條件為甲醇—0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相，峰形對稱，無拖尾現(xiàn)象，槲皮素保留時(shí)間為14 min左右，山柰素保留時(shí)間為23 min左右，異鼠李素保留時(shí)間在27 min左右。

4 小結(jié)

在五味沙棘泡騰片的研制過程中,根據(jù)方中各味藥材中主要有效部位或有效成分的理化性質(zhì),確實(shí)了五味沙棘泡騰片的工藝路線。采用正交試驗(yàn)法對醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化，以槲皮素、山柰素和異鼠李素的總量為指標(biāo)，優(yōu)選了最佳煎煮工藝條件。通過劑型改進(jìn)，對全粉末的五味沙棘散中全部藥材進(jìn)行了提取，減少了服藥量，有助于有效部位或有效成分的溶出和吸收，加快了藥品的起效速度，同時(shí)便于服用、攜帶和貯藏，為患者提供了一種全新的給藥選擇方案。

對于蒙藥的標(biāo)準(zhǔn)建立為今天蒙醫(yī)藥的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，從而強(qiáng)化蒙醫(yī)藥在防病、治病、保護(hù)和增進(jìn)人民群眾的健康事業(yè)中發(fā)揮獨(dú)特的、重要的和不可替代的作用，從而形成保持蒙醫(yī)藥特色的標(biāo)準(zhǔn)體系，建立規(guī)范的、科學(xué)的蒙藥材內(nèi)在的質(zhì)量控制體系，保證蒙藥制劑的質(zhì)量。