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1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000

肝纖維化是由于各種原因?qū)е碌穆愿螕p傷過程，可使以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrixc, ECM)在肝臟中大量沉積。肝纖維化如果沒有及時(shí)有效的治療，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，并誘發(fā)肝細(xì)胞功能障礙及門靜脈高壓等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重則可能導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[1]。但是肝纖維化是可逆的，及時(shí)阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，是防治肝硬化和慢性肝病，提高肝病患者的生命質(zhì)量和生存率的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells, HSC)的活化增殖是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，HSC被激活后可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并誘導(dǎo)促纖維化細(xì)胞因子的分泌，增加膠原的合成，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[2-5]。Ca2+對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)起到極其重要的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加是細(xì)胞增殖分裂的必要條件[6-7]。在HSC活化過程中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+是諸多生長(zhǎng)因子、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及細(xì)胞因子等發(fā)揮促生長(zhǎng)和增殖作用的主要介質(zhì)之一，因此通過測(cè)定HSC內(nèi)Ca2+濃度可以間接了解其生長(zhǎng)情況。

近年來許多藥物如秋水仙堿、還原型谷胱甘肽、水飛薊賓等都被用于肝纖維化的治療，但臨床效果卻不理想[8]。水飛薊賓(Silybin, SF)是水飛薊素中含量最高、活性最強(qiáng)的成分，因其具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等藥理作用，臨床廣泛用于各種肝膽疾病的治療[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物具有促進(jìn)組織修復(fù)、消炎止痛、抗肝纖維化和抗腫瘤,增強(qiáng)免疫活性等藥理作用[11-12]。肝龍膠囊(Ganlong capsule, GL)是從美洲大蠊中提取的以粘糖氨酸和復(fù)合核苷類為主要成分的抗肝炎新藥[13]，具有療效確切不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于臨床實(shí)踐。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，單用水飛薊賓對(duì)HSC的抑制作用不如水飛薊賓聯(lián)合肝龍。含藥血清經(jīng)過了機(jī)體代謝可以更好的模擬藥物的最終有效成分，更接近藥物在體內(nèi)的藥理效應(yīng)，從而可以更準(zhǔn)確的研究其藥理機(jī)制。本研究選用大鼠HSC，分別給予水飛薊賓單用及水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清處理，觀察其對(duì)HSC增殖活性的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD雄性健康成年大鼠，體重(180±20) g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(湘)2011-0003；大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)購(gòu)自中科院昆明細(xì)胞庫(kù)(編號(hào):KCB200703YJ)。

1.1.2 藥物與試劑 水飛薊賓膠囊(批號(hào)：16041601，天津天士力圣特制藥有限公司)；肝龍膠囊(批號(hào)：550706087，昆明賽諾制藥有限公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；噻唑藍(lán)(MTT)、Hepes(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；碳酸氫鈉(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；Fluo-3/AM(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific)；CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus)；離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 含藥血清的制備 SD雄性大鼠隨機(jī)分為肝龍組(150 mg/kg)，水飛薊賓組(28 mg/kg)及空白對(duì)照組(0.9% NaCl溶液),按1 mL/100g給藥容量，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃7 d，最后一次灌胃前禁食不禁水12 h，末次灌胃給藥1 h后，用異氟烷麻醉腹主動(dòng)脈取血，采用一次性非抗凝真空采血管收集全血，靜置4 h，3000 r/min離心10 min,分離血清，經(jīng)56 ℃恒溫滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)及藥物分組 從-80 ℃超低溫冰箱取出HSC-T6細(xì)胞，用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素抗生素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞。根據(jù)水飛薊賓含藥血清(7.5%、15%、30%)及肝龍膠囊含藥血清(7.5%、15%、30%)進(jìn)行2因素3水平完全實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)設(shè)空白血清對(duì)照組，水飛薊賓及肝龍膠囊含藥血清濃度編號(hào)見表1。

表1 水飛薊賓及肝龍膠囊含藥血清濃度編號(hào)

1.3.3 MTT法檢測(cè)水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對(duì)HSC增殖的影響 用0.25%的胰酶將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞消化后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為6×104個(gè)/mL接種于96孔板，細(xì)胞懸液終體積為100 μL，置于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行無菌培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛貼壁后更換不同濃度含藥血清的培養(yǎng)基及空白培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。棄去舊培養(yǎng)基用PBS小心清洗2遍，將20 μL濃度為5 mg/mL的MTT依次加入各孔，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h，之后每孔分別加入150 μL的DMSO，充分振蕩，使甲臜充分溶解，用多功能酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度值(A490)。

細(xì)胞存活率=(OD藥物組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)；

細(xì)>胞>抑>制>率>=1-(OD藥物組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)。

1.3.4 激光掃描共聚顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度 根據(jù)水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對(duì)HSC增殖作用的影響發(fā)現(xiàn)，30%水飛薊賓聯(lián)合不同濃度肝龍含藥血清對(duì)HSC的抑制作用較好，故本次研究用激光掃描共聚顯微鏡檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的影響。將培養(yǎng)的細(xì)胞取出，棄去含胎牛血清培養(yǎng)基，用HBSS溶液洗滌細(xì)胞至少3次；在每孔細(xì)胞中加入30 μL Fluo 3-AM工作液；37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，之后除去工作液,為充分洗去工作液，加入HBSS溶液清洗細(xì)胞3次，然后每孔加入20 μLHBSS溶液覆蓋細(xì)胞；37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育約25 min后，用激光共聚焦顯微鏡來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。設(shè)置掃描條件：20×倍鏡下、激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，10%激光強(qiáng)度、PMT(1100)。計(jì)算整個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，記錄熒光強(qiáng)度的相對(duì)值(%)以觀察Ca2+濃度動(dòng)態(tài)變化。計(jì)算公式：Ca2+濃度=Kd( F-Fmin)/( Fmax-F)。(F：實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度；Fmax：0.1%TritonX-100 測(cè)得的熒光強(qiáng)度值；Fmin：5 mM EGTA 測(cè)得的熒光強(qiáng)度值；Kd =400 nmol/L)[14]。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對(duì)HSC增殖的作用 不同濃度水飛薊賓單用及聯(lián)合不同濃度肝龍含藥血清分別作用HSC24、48和72 h，單用7.5%和15%水飛薊賓含藥血清組對(duì)HSC的增殖作用不明顯(P>0.05)，單用30%水飛薊賓含藥血清處理24 h時(shí)，其抑制率為16.5%；水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清組對(duì)HSC抑制作用顯著高于單用水飛薊賓含藥血清組(P<0.01)。見表2。

表2 水飛薊賓單用及合用肝龍含藥血清對(duì)HSC增殖的影響

注：與單用水飛薊賓含藥血清組相比，▲P<0.01。

2.2 30%水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對(duì)HSC內(nèi)Ca2+濃度的影響 在單獨(dú)用藥情況下：與空白血清組相比，水飛薊賓組HSC內(nèi)Ca2+濃度在24、48、72 h分別降低27.80%、67.06%、50.70%；聯(lián)合用藥時(shí)：與單用水飛薊賓含藥血清組相比，水飛薊賓+7.5%肝龍組HSC內(nèi)Ca2+濃度在24 h時(shí)一過性增加，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在48 h時(shí)HSC內(nèi)Ca2+濃度降低26.49%，在72 h 時(shí)HSC內(nèi)Ca2+濃度增加29.34%；水飛薊賓+15%肝龍組HSC內(nèi)Ca2+濃度在24、48、72 h分別降低13.46%、29.34%、36.49%；水飛薊賓+30%肝龍組HSC內(nèi)Ca2+濃度在24、48 h分別增加0.78%、26.77%，在72 h降低15.97%。如圖1所示。

3 討論

近年來我國(guó)肝硬化、肝癌的患病率居高不下，肝纖維化作為這兩大疾病的必經(jīng)階段,是一個(gè)可逆的過程。本研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清在體外對(duì)HSC增殖活性的影響，結(jié)果表明水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清對(duì)HSC的抑制作用強(qiáng)于單用水飛薊賓,隨著對(duì)肝纖維化機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，正常肝細(xì)胞經(jīng)酒精、病毒、藥物等作用損傷，產(chǎn)生炎癥，刺激并激活HSC，激活的HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步誘發(fā)促纖維化細(xì)胞因子分泌和增加膠原的合成，使細(xì)胞外基質(zhì)過量產(chǎn)生，引起肝纖維化[2-3]。HSC在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的增殖能力明顯增強(qiáng)。因此認(rèn)為可以通過抑制HSC的活化和增殖來逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

通過激光共聚焦測(cè)定HSC內(nèi)Ca2+濃度發(fā)現(xiàn)，與單用水飛薊賓相比，肝龍聯(lián)合水飛薊賓含藥血清在一定程度上可使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯降低，其中水飛薊賓聯(lián)合15%肝龍含藥血清時(shí)，HSC內(nèi)游離Ca2+濃度降低最為明顯。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與HSC生長(zhǎng)和增殖作用密切相關(guān)，它能參與諸多細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及氧化應(yīng)激產(chǎn)物等對(duì)HSC的調(diào)控。這些因子通過增加細(xì)胞膜鈣通道活性，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，引起HSC的收縮和有絲分裂[7]。并且，已有研究表明[15]大鼠HSC內(nèi)Ca2+濃度增加會(huì)引起HSC收縮。值得注意的是，與單用水飛薊賓組相比，水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清作用HSC 24、48 h，在肝龍含藥血清濃度為15%時(shí)可降低HSC內(nèi)游離Ca2+濃度，而在肝龍含藥血清濃度為30%時(shí)可增加HSC內(nèi)游離Ca2+濃度，在一定程度上表現(xiàn)出肝龍對(duì)HSC內(nèi)游離Ca2+具有雙向調(diào)節(jié)作用。推測(cè)肝龍對(duì)Ca2+的抑制與促進(jìn)作用可能與藥物濃度、作用時(shí)間和藥物的體內(nèi)代謝有關(guān)，而對(duì)不同疾病還需要考慮病情來選擇最佳給藥劑量，但這還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，肝龍能夠增強(qiáng)水飛薊賓含藥血清對(duì)HSC的抑制作用，從而達(dá)到增強(qiáng)在體外的抗肝纖維化的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。但本次實(shí)驗(yàn)尚存在許多不足，本研究所用的細(xì)胞為大鼠肝星狀細(xì)胞，與人源細(xì)胞存在一定的種屬差異，因此下一步可以選用人源細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來加以證實(shí)，同時(shí)對(duì)肝龍的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，為臨床水飛薊賓和肝龍膠囊的聯(lián)合應(yīng)用提供更充分的依據(jù)。