劉成軍 涂艷琴 王藹明 商 微 王偉周 李 敏 沈玉良

1 肇慶市西江醫(yī)院生殖中心(肇慶526000)2 海軍總醫(yī)院生殖中心(北京100048)

自發(fā)性流產(chǎn)在正常生育人群中占10%～15%，而在生育力低下的人群中所占比例更高[1]。目前，自發(fā)性流產(chǎn)的患者呈上升趨勢，其中將近50%為不明原因流產(chǎn)。這些不明原因流產(chǎn)患者夫妻雙方染色體核型分析正常，并且女方身體不存在解剖異常，其內(nèi)分泌水平也在正常范圍內(nèi)，自身免疫系統(tǒng)沒有明顯異常，不存在生殖道感染等常見疾病；而根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)對(duì)男性精液的精子濃度、形態(tài)和活力檢查也不存在異常。這些患者本身能懷孕，也說明了男方精子不存在數(shù)量不足、活力低下等問題。精子DNA損傷的是男性不育的一項(xiàng)新標(biāo)準(zhǔn)，很多醫(yī)院將這一項(xiàng)檢查納入了男性精子必查項(xiàng)目。精子DNA完整性對(duì)卵子受精、胚胎發(fā)育特別是8細(xì)胞以后的發(fā)育和著床等都是一個(gè)重要的影響因素[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，精子DNA損失與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)，可能是其原因之一[ 3]。2011年，我們的臨床統(tǒng)計(jì)結(jié)果也認(rèn)為精子DNA損失與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有一定關(guān)系[4]。目前，患者的就醫(yī)意識(shí)增強(qiáng)了，一般患者第一次流產(chǎn)后就會(huì)就醫(yī)，本研究比較流產(chǎn)一次的夫妻和正常夫妻男方精子DNA損失有無差異。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

通過對(duì)門診病歷的篩選，收集了31例有一次不明原因流產(chǎn)史的患者最為試驗(yàn)組。試驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)是夫妻雙方染色體核型分析結(jié)果均為正常且均無家族遺傳病，沒有自愿人工流產(chǎn)史。同時(shí)女方無解剖及內(nèi)分泌異常，沒有生殖道炎癥等常見病因。同時(shí)收集33例無流產(chǎn)史的患者作為對(duì)照組。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)為夫妻有正常妊娠史，其中男性精液常規(guī)檢查無明顯異常。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑：主要用到的儀器是重慶光學(xué)儀器廠出產(chǎn)光學(xué)顯微鏡(型號(hào)為XSZ-HS7)。精子DNA損傷檢測試劑購自西班牙Halotech公司開發(fā)的試劑盒，主要包括凝膠、瑞氏染色液、細(xì)胞裂解液和細(xì)胞酸性變性等。

兩組的精液量、精子密度及活力均無差異，實(shí)驗(yàn)組男方年齡(32.52)小于對(duì)照組(34.03)，有差異(P=0.03)，但實(shí)驗(yàn)組的DFI(27.10)要高于對(duì)照組(22.25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。見表1。

表1精子DFI與流產(chǎn)的關(guān)系

2 討 論

和普通的體細(xì)胞相比，由于精子中的大部分組蛋白被魚精蛋白替換，其DNA高度致密化，增加了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。精子DNA鏈損傷可能會(huì)造成其功能缺失, 損傷機(jī)理主要有以下三種：第一，在精子形成過程中，染色質(zhì)凝集不完全，特別是魚精蛋白的缺失，會(huì)造成精子DNA不穩(wěn)定，導(dǎo)致DNA損傷。在動(dòng)物模型中，敲除魚精蛋白基因后魚精蛋白缺失，精子DNA損傷，而且精子受精能力下降[6]。而在不育的男性中，約有5%～15%的男性缺乏魚精蛋白[7]。第二，細(xì)胞凋亡異常也許是引起的精子DNA損傷的一個(gè)原因，但這種觀點(diǎn)還存在爭議[8]。在精子發(fā)生過程中，75%以上的精子發(fā)生凋亡。這種選擇性的凋亡程序使得部分早期精子避免了凋亡，而不正常的精子一般都會(huì)發(fā)生凋亡[9]。Sakkas[8]等人認(rèn)為可能某些DNA損傷的精子逃避了凋亡，這樣使得精液中的精子DNA損傷精子的比率有所增加。生精細(xì)胞表面上的Fas 蛋白結(jié)合可以與其配體(FasL) 結(jié)合，從而啟動(dòng)生精細(xì)胞的凋亡程序。正常生育男性中Fas 陽性精子比異常者Fas 陽性精子少，說明這些人群中生精細(xì)胞清除DNA 受損精子的功能可能存在異常[10]。精子凋亡異常引起DNA 損傷精子比例增加也可能與半胱天冬酶(caspase) 激活有關(guān)[11]。McVicar[12]等人研究在射出體外的精子中凋亡標(biāo)記物時(shí)發(fā)現(xiàn)，生育男性的精子未發(fā)現(xiàn)攜帶Fas，而畸形精子癥及弱精癥等精子參數(shù)異常的男性精子Fas 陽性率則較高。第三，氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress)。正常生理濃度的活性氧(reactive oxygen species，ROS) 有利于精子的正常功能，但高濃度的活性氧可能導(dǎo)致精子DNA 單鏈或雙鏈部分?jǐn)嗔褟亩斐蒁NA損傷，研究發(fā)現(xiàn)大約有25%～40%不育患者精液中存在高水平活性氧[13]。適當(dāng)?shù)难趸磻?yīng)對(duì)精子功能有益，但過量的氧化反應(yīng)對(duì)精子DNA會(huì)產(chǎn)生損傷。這是造成精子DNA損傷的一個(gè)重要原因[14]。

精子DNA損傷檢測方法有很多種，常用的有精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(SCSA) 、精子染色質(zhì)擴(kuò)散分析(SCD)。精子DNA檢測一個(gè)重要的意義就是為男性不育提供參考，為助孕治療提供參考。與正常男性相比，不育男方的精子DNA損傷較高[15]。但不同方法的檢測結(jié)果閾值不同，還沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(sperm chromatin structure assay, SCSA)被公認(rèn)為檢測精子DNA損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其檢測結(jié)果客觀、準(zhǔn)確度高，但SCSA操作方法不便，且需要流式細(xì)胞儀等較昂貴的設(shè)備。Fernández等人發(fā)明了利用精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測精子DNA損傷，這種方法操作相對(duì)簡單，不需要昂貴設(shè)備，一般醫(yī)療機(jī)構(gòu)都有條件開展[5]。而且通過對(duì)比SCD與SCSA兩種檢測方法發(fā)現(xiàn)兩者有很高的一致性，這說明了SCD方法檢測精子DNA損傷同時(shí)具備結(jié)果準(zhǔn)確可靠和費(fèi)用低廉的優(yōu)點(diǎn)[5]。

Bungum等運(yùn)用SCSA法檢測精子DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)DFI > 30 %時(shí)， 人工授精的妊娠概率接近于零[16]。此外, 利用TUNEL 法評(píng)估精子DNA損傷發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DFI>12 %時(shí)不能正常妊娠，DFI在10%～12%之間會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)[17]。因此，在人工授精中DFI具有較好的評(píng)估預(yù)后作用。但有關(guān)精子DNA損傷與IVF/ICSI結(jié)局的關(guān)系尚無定論。Morris等認(rèn)為精子DNA損傷比例增加與IVF 失敗相關(guān)[18]。而Ahmadi等研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA損傷比例高的患者的受精率和正常人群沒有明顯差異，但囊胚形成率明顯降低并影響胚胎種植[19]。對(duì)最近的研究做比較分析可以看出，精子DNA損傷對(duì)輔助生殖結(jié)局存在一定的影響，但具體對(duì)什么產(chǎn)生影響，現(xiàn)在還沒有共識(shí)。存在這些分歧一方面是由于樣本量較小，另一方面可能是由于精子DNA損傷檢測方法不同；另外受精的過程中，本身就有一個(gè)選擇精子的過程，DNA受損的精子獲得受精存在一定的幾率，這樣結(jié)果可能就有較大差異。

從理論上講，胚胎發(fā)育到第三天的時(shí)候基因組被激活，父源基因開始起作用，如果DNA損傷嚴(yán)重，胚胎自身無法修復(fù)，這樣可能會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育潛力下降，囊胚形成率降低；甚至可能影響妊娠率，也可能引起流產(chǎn)。 有人研究發(fā)現(xiàn)高DFI與流產(chǎn)率有密切關(guān)系，行ICSI授精術(shù)的患者中高DFI組流產(chǎn)率顯著增加(P=0.009)。 Evenson等人采用SCSA方法檢測精子DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著DFI的增加妊娠幾率降低。而且在流產(chǎn)患者中，高DFI占39%[20]。近年，有多篇報(bào)道均精子DNA損失與習(xí)慣性流產(chǎn)有關(guān)，精子DNA損失率越高，流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)越大[21]。

但以上研究多以復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者為研究對(duì)象，還沒有人比較研究精子DNA損失與一次不明原因流產(chǎn)的關(guān)系，本研究就此做了對(duì)比研究。一般情況下，隨著男性年齡的增加DFI呈增高的趨勢[22]， 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組男方年齡顯著高于實(shí)驗(yàn)組，但自發(fā)流產(chǎn)患者男性配偶的DFI明顯高于正常組。這更能說明不明原因的自發(fā)流產(chǎn)與男方精子DFI密切相關(guān)，隨著DFI的增加，流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，對(duì)于流產(chǎn)的夫婦，男方精子DNA損失的檢測很有必要，不僅僅是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，對(duì)任何自發(fā)流產(chǎn)的患者都有必要檢查男方精子DNA的損失。

引起精子DNA損傷的原因有很多，如化療、放療，還有環(huán)境因素、生活節(jié)奏的加快、飲食、吸煙、酗酒等等?；加邪┌Y的年輕男性即使在癌癥治療前精子質(zhì)量也會(huì)較差，精子DNA損傷嚴(yán)重。癌癥患者運(yùn)用化療或者放療后，隨著藥物劑量的累積和放療時(shí)間的積累，會(huì)導(dǎo)致絕對(duì)的不育，說明目前化療藥物對(duì)生精功能有毒害[23]。放化療同樣會(huì)導(dǎo)致睪丸生精功能受損、精子DNA損傷增加[24]。男性生殖管道感染和炎癥(如附睪炎等)會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞增加進(jìn)而引發(fā)白細(xì)胞精子癥，氧化應(yīng)激反應(yīng)增多，并由此造成精子DNA損傷增加[25]。據(jù)報(bào)道感染支原體和衣原體的男性，往往會(huì)導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，并且精子DNA損傷率增加，妊娠率下降[26]。

綜述所述，本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果相符，精子DNA損傷會(huì)影響胚胎的發(fā)育潛力并增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。