范華農(nóng)，龔義鳳

作者單位：1浠水縣中醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 黃岡 438200；2繁昌縣中醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 242400

子宮肌瘤又稱子宮平滑肌瘤，由平滑肌及結(jié)締組織組成，是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的良性腫瘤，育齡期婦女平均發(fā)病率約為77%，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)［1-2］。其常引起月經(jīng)過(guò)多、不孕、流產(chǎn)等疾病，也是女性子宮切除的常見(jiàn)原因，嚴(yán)重影響病人身心健康。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，雌、孕激素是子宮肌瘤形成發(fā)展的重要因素，且與雌、孕激素受體（ER、PR）有很重要的聯(lián)系，還與子宮平滑肌細(xì)胞蛋白激酶C（PKC）關(guān)系密切。PKC是調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞收縮、受體結(jié)合、細(xì)胞增殖分化的信號(hào)傳遞通道的重要物質(zhì)，其降低有促進(jìn)體外培養(yǎng)的子宮平滑肌瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的作用，桂枝茯苓膠囊由桂枝、茯苓、牡丹皮等中藥組成，具有活血化瘀，緩消癥塊之效。臨床應(yīng)用于子宮肌瘤療效顯著［3］。筆者通過(guò)觀察PR和PKC對(duì)造模大鼠子宮肌瘤的表達(dá)影響，進(jìn)一步探析桂枝茯苓膠囊對(duì)子宮肌瘤的作用機(jī)制。

本研究起止時(shí)間為2016年1月至2017年1月。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑桂枝茯苓流浸膏：桂枝茯苓膠囊（成分相同）（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，濃度0.31 g/mL，批號(hào)20160507）用量按成人與大鼠等效用量換算而成。米非司酮片：每片25 mg（北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號(hào)43181709）配制成濃度為0.27 mg/mL的溶液備用（溶于丙二醇中）。黃體酮注射液：20 mg/mL（浙江仙琚藥業(yè)，批號(hào)021603）。苯甲酸雌二醇注射液：2 mg/mL（天津金耀氨基酸藥業(yè)，批號(hào)021865）。PR單克隆抗體（德國(guó)Biometro公司）。儀器：Leica熒光倒置顯微鏡（上海洛豐精密檢測(cè)儀器有限公司）；Thermo-CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司）；SP試劑盒（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2 動(dòng)物分組SPF級(jí)Wistar雌性大鼠體質(zhì)量范圍180～220 g，共81只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組14只，造模組67只。本研究符合一般實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)原則。

1.3 造模方法正常組：14只，肌注0.9%生理鹽水0.05 mL（3次/周）；造模組：67只，肌注苯甲酸雌二醇0.06 mL（含藥量0.12 mg，3次/周），同時(shí)肌注黃體酮0.05 mL（含藥量1 mg，1次/周）；共16周。造模過(guò)程中正常組1只丟失，造模組2只丟失及6只意外死亡，造模結(jié)束時(shí)正常組共13只，造模組共59只。

1.4 給藥方法造模組59只模型大鼠分為三組：模型組17只，桂枝茯苓組21只，米非司酮組21只。每只模型組大鼠每天灌服0.9%生理鹽水2 mL，其他兩組每只大鼠每天分別灌服桂枝茯苓流浸膏或米非司酮溶液2 mL，共灌服12周（用量按成人與大鼠等效用量換算而成）。灌胃時(shí)間較長(zhǎng)，結(jié)束時(shí)大鼠死亡11只，剩余正常組13只，模型組16只，桂枝茯苓組17只，米非司酮組15只。

1.5 觀測(cè)指標(biāo)大鼠在灌胃第12周時(shí)，取大鼠子宮組織放入甲醛溶液中固定，觀察大鼠子宮各項(xiàng)指標(biāo)并用SP法檢測(cè)各組子宮平滑肌組織的PR，免疫組化法計(jì)算各組PKC的活性。

1.6 免疫組化方法（1）孕激素受體染色流程：標(biāo)本切片脫蠟水化→甲醇處理切片→水洗、PBS洗→加血清孵→PR單抗放置過(guò)夜→PBS洗→加入SP復(fù)合物孵育→PBS洗→鏈霉卵白素孵→PBS洗→DAB-孵育→PBS洗，水洗→Harris蘇木素復(fù)染→水洗→分化，藍(lán)化，脫水封片。

（2）PKC提?。喝〈笫笞訉m平滑肌細(xì)胞→緩沖液孵15 min→粉碎細(xì)胞→離心→上清液為細(xì)胞質(zhì)PKC提取物→沉淀→離心→胞膜PKC提取物（上清液）。

1.7 結(jié)果判定（1）切片中不同高倍視野細(xì)胞計(jì)數(shù)共1 000個(gè)，得出陽(yáng)性率，細(xì)胞核中棕黃色顆粒為孕激素受體陽(yáng)性染色，其中無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞以（－）表示；陽(yáng)性染色細(xì)胞＜25%（+）；25%＜陽(yáng)性染色細(xì)胞＜50%（++），陽(yáng)性染色細(xì)胞＞50%（+++）。

（2）將PKC加入到含有組蛋白、γ-32 P-ATP和磷脂酰絲胺酸的緩沖液中，溫浴30 min，30℃，用γ-閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)放射性，計(jì)算PKC的活性（PKC活性單位：fmol·mg-1min-1）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析+HSD-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠質(zhì)量、子宮質(zhì)量及子宮系數(shù)差異比較本實(shí)驗(yàn)研究參照相關(guān)文獻(xiàn)資料［3-4］改進(jìn)后建立子宮肌瘤模型。監(jiān)測(cè)模型大鼠質(zhì)量、子宮質(zhì)量、子宮系數(shù)（即子宮質(zhì)量/大鼠質(zhì)量），其結(jié)果均明顯大于正常組大鼠（P＜0.05）；而用藥組大鼠質(zhì)量、子宮質(zhì)量、子宮系數(shù)低于模型組（P＜0.05）；桂枝茯苓組大鼠質(zhì)量、子宮質(zhì)量、子宮系數(shù)與米非司酮組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠質(zhì)量、子宮質(zhì)量和子宮系數(shù)/±s

表1 各組大鼠質(zhì)量、子宮質(zhì)量和子宮系數(shù)/±s

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常組模型組桂枝茯苓組米非司酮組F值P值鼠數(shù)13 16 17 15鼠質(zhì)量/g 185.2±19.8 348.3±50.3a 335.2±46.5ab 325.7±30.2ab 50.39 0.000子宮質(zhì)量/mg 1.43±0.56 4.67±1.31a 3.55±0.73ab 3.50±0.82ab 30.74 0.000子宮系數(shù)/%0.77±0.12 1.34±0.11a 1.06±0.51b 1.07±0.48b 5.736 0.002

2.2 各組大鼠子宮平滑肌組織中PR陽(yáng)性率及平滑肌細(xì)胞PKC的表達(dá)差異比較模型組大鼠子宮平滑肌組織細(xì)胞核中PR的陽(yáng)性率、細(xì)胞膜PKC的活性均極顯著高于正常組（P＜0.05），細(xì)胞質(zhì)PKC的活性低于正常組（P＜0.05）。

用藥后，PR陽(yáng)性表達(dá)率，桂枝茯苓組與模型組比較下降極其顯著（P＜0.05），米非司酮組與模型組比較下降顯著（P＜0.05），桂枝茯苓組下降更明顯接近正常組水平（P＞0.05）。

PKC細(xì)胞膜的活性表達(dá)，桂枝茯苓組與模型組比較下降極其顯著（P＜0.05），米非司酮組細(xì)胞膜的活性下降不明顯與模型組相比較多差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，桂枝茯苓組更接近正常組。

PKC細(xì)胞質(zhì)的活性表達(dá)，桂枝茯苓組與模型組比較升高明顯（P＜0.05），桂枝茯苓組PKC細(xì)胞質(zhì)的活性升高多接近正常組表達(dá)；米非司酮組與模型組比較升高不明顯。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠子宮平滑肌PR陽(yáng)性率及平滑肌細(xì)胞PKC活性表達(dá)/± s

表2 各組大鼠子宮平滑肌PR陽(yáng)性率及平滑肌細(xì)胞PKC活性表達(dá)/± s

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常組模型組桂枝茯苓組米非司酮組F值P值鼠數(shù)13 16 17 15細(xì)胞膜/fmol·mg-1·min-1 19.31±3.84 37.24±7.12a 21.62±5.23b 36.54±6.79a 37.27 0.000細(xì)胞質(zhì)/fmol·mg-1·min-1 15.43±4.59 11.68±4.68a 16.50±2.80b 13.23±3.45b 4.90 0.004 PR陽(yáng)性率（給藥后第12周）/%28.34±2.4 75.25±4.1a 32.25±2.8b 40.22±3.5b 656.10 0.000

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤是激素依賴性良性腫瘤，雌、孕激素在子宮肌瘤的生長(zhǎng)中起協(xié)同作用，此外還與子宮平滑肌PKC活性密切相關(guān)［4-5］。相關(guān)研究表明［6-7］，子宮肌瘤內(nèi)ER和PR的含量高于子宮正常肌組織，使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRH-α）治療后的子宮肌瘤中ER和PR的表達(dá)均明顯下降，說(shuō)明肌瘤的生長(zhǎng)與雌、孕激素受體有很重要聯(lián)系。Kawaguchi等［8］發(fā)現(xiàn)雌、孕激素均導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂率增加，與單用雌激素或無(wú)激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的相比，在雌、孕激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞肌絲和致密體顯著增多，增生最活躍。Matsuo等［9］發(fā)現(xiàn)凋亡抑制基因產(chǎn)物Bcl-2蛋白和增生抗原Ki-67在肌瘤組織中明顯增多，表明孕激素是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活化作用，實(shí)現(xiàn)提高有絲分裂率，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的以促進(jìn)肌瘤生長(zhǎng)。本研究與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道研究結(jié)果一致，模型組子宮肌瘤平滑肌組織的細(xì)胞核中PR陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組。表明局部高PR濃度和高孕激素狀態(tài)可能是子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。桂枝茯苓組與模型組相比，局部PR陽(yáng)性表達(dá)率明顯下降，由于孕激素具有促進(jìn)肌瘤生長(zhǎng)并通過(guò)與PR結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)來(lái)降低PR含量的作用，進(jìn)一步證實(shí)了桂枝茯苓膠囊抗增生、抗肌瘤機(jī)制。

實(shí)體腫瘤微環(huán)境中缺氧是其基本特征之一，細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下誘導(dǎo)血管生成、缺氧代謝等密切相關(guān)的基因表達(dá)是為適應(yīng)缺氧環(huán)境［10-12］，缺氧刺激子宮平滑肌細(xì)胞可以引起其細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)PKC活性的明顯改變。細(xì)胞質(zhì)中的PKC活性下降，顯示缺氧可激活細(xì)胞質(zhì)中的PKC信號(hào)傳導(dǎo)通路使細(xì)胞質(zhì)中PKC活化。PKC是一種重要的信息傳導(dǎo)蛋白，介導(dǎo)生物信號(hào)從細(xì)胞膜向細(xì)胞核的傳遞，構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞分化、增殖和凋亡起重要調(diào)節(jié)作用［13-15］。本研究中細(xì)胞PKC是調(diào)節(jié)子宮平滑肌細(xì)胞收縮、受體結(jié)合、細(xì)胞增殖分化的信號(hào)傳遞通道的重要物質(zhì)；主要以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)PKC激活時(shí)，會(huì)發(fā)生質(zhì)膜轉(zhuǎn)位［16］，桂枝茯苓膠囊與米非司酮組比較更能顯著改善細(xì)胞PKC活性，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞PKC從病理性異常狀態(tài)恢復(fù)到接近正常水平，而且改善了子宮平滑肌細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，切斷子宮平滑肌細(xì)胞增殖分化信號(hào)傳遞通道，從而達(dá)到抑制肌瘤的目的。

本研究提示桂枝茯苓膠囊顯著下調(diào)子宮肌瘤模型大鼠平滑肌細(xì)胞PR、PKC陽(yáng)性表達(dá)，改善子宮平滑肌細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，抑制血管生成，切斷子宮平滑肌細(xì)胞增殖分化信號(hào)傳遞通道，是桂枝茯苓膠囊縮瘤、消瘤臨床療效顯著的作用機(jī)制之一。